基因工程酶法生產(chǎn)谷胱甘肽.pdf

1、谷胱甘肽是一種重要的非蛋白巰基物質(zhì)，在食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本課題從經(jīng)過基因工程法改造的重組菌出發(fā)，對參與體外合成GSH的谷胱甘肽雙功能合成酶(GshF)和偶聯(lián)ATP再生相關(guān)的多聚磷酸激酶(PPK)的表達(dá)方法進(jìn)行了優(yōu)化，并研究了雜蛋白表達(dá)較多的粗酶液的分離方法和分離特性。最后針對研究過程中包涵體現(xiàn)象較嚴(yán)重的多聚磷酸激酶進(jìn)行了模擬結(jié)構(gòu)分析，并對一類更有優(yōu)勢的PPK酶進(jìn)行了定向進(jìn)化研究，顯著提高了酶的活力。具體的研究內(nèi)容

2、如下:
　　(1)為了提高表達(dá)量，本課題首先對重組質(zhì)粒的表達(dá)菌種進(jìn)行優(yōu)化，利用了BL21、Rosetta、OrigamB三種E.coli表達(dá)菌對比誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Rosetta菌的效果最好。針對PPK酶的包涵體現(xiàn)象，通過重新構(gòu)建不同載體的重組質(zhì)粒pETDuet-ppk，獲得的酶用于體外合成GSH的產(chǎn)量提高了1.718倍。同時利用分子伴侶與目的酶共表達(dá)以促進(jìn)目的酶的可溶性表達(dá)，重組質(zhì)粒pETDuet-ppk同分子伴侶共表達(dá)后效果明顯，

3、獲得的PPK酶用于體外合成GSH的產(chǎn)量提高至1.481倍，PPK酶酶活提高至1.820倍。
　　(2) GshF酶和PPK酶的粗酶液的整體純度較低，需要對粗酶液進(jìn)行分離純化研究。本課題實(shí)驗(yàn)確定了GshF酶和PPK的最適硫酸銨鹽析飽和度為40％。鹽析沉淀中的鹽成分對酶活產(chǎn)生的抑制現(xiàn)象可以通過聯(lián)合30KD聚醚砜膜的超濾處理完成有效的脫鹽和濃縮。冷丙酮對GshF粗酶液可純化倍數(shù)為1.445，收率為87.64％;冷丙酮和鹽析共同處理時純化

4、倍數(shù)可達(dá)到1.637，收率為88.99％。
　　(3)PPK酶表達(dá)中的包涵體現(xiàn)象限制了酶表達(dá)量和酶活，不僅影響了酶法體外合成GSH的整體產(chǎn)量，也不利于PPK酶分離純化的研究。本課題通過結(jié)構(gòu)模擬分析的方法對比了不同家族的PPK酶，研究發(fā)現(xiàn)ClassⅡ PPK(PPK2)酶比實(shí)驗(yàn)中采用的ClassⅠ PPK(PPK1)酶在ATP再生中更具優(yōu)勢。在此基礎(chǔ)上對PPK2酶進(jìn)一步定向進(jìn)化，建立了高通量篩選方法及優(yōu)化易錯PCR突變率，使用易錯P