Wiskott-Aldrich綜合征和DOCK8免疫缺陷綜合征T細(xì)胞受體多樣性研究.pdf

1、第一、二部分 Wiskott-Aldrich綜合征T細(xì)胞受體多樣性研究
　　濕疹，血小板減少伴免疫缺陷綜合征(Wiskott-Aldrichsyndrome，WAS，OMIM301000)是一種以血小板減少、濕疹、免疫缺陷、易患自身免疫疾病和淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤為特征的原發(fā)性免疫缺陷疾病。WAS的發(fā)病率約為1-10/1，000，000新生男嬰。該疾病系由位于X染色體上的WAS基因突變所致。WAS基因編碼WAS蛋白(WASprotein

2、，WASp)，WASp是一種造血系統(tǒng)特異的肌動(dòng)蛋白核調(diào)節(jié)蛋白，接受細(xì)胞膜表面的信號(hào)分子激活。若不經(jīng)治療，WAS患者的平均壽命為15歲。由于WASp表達(dá)于除紅細(xì)胞以外的所有的造血系統(tǒng)細(xì)胞，WAS突變廣泛影響多種免疫細(xì)胞功能。然而，由于T細(xì)胞缺陷被認(rèn)為是WAS病人免疫缺陷的核心問(wèn)題，WAS基因突變是否會(huì)不同程度影響不同T細(xì)胞亞群的T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)多樣性尚屬未知。
　　目的:研究WAS病人不同T細(xì)胞

3、亞群T細(xì)胞受體β鏈可變區(qū)（TCRβ CR體體variable gene，TCR Vβ）受體譜限制性改變的程度及模式。
　　方法:收集23例年齡在2月-22歲的WAS患者及25例同齡正常對(duì)照兒童新鮮外周血標(biāo)本，分離單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral bloodmononuclear cell, PBMC)，采用流式細(xì)胞術(shù)分選CD4+、CD8+T細(xì)胞，進(jìn)一步分選足夠數(shù)量的初始及記憶CD4+、CD8+T細(xì)胞，從總的外周血及分選的各群細(xì)胞中

4、立即提取RNA，并合成cDNA。
　　1.采用互補(bǔ)決定區(qū)3掃描譜型分析方法(CDR3 spectratyping)分析比較WAS及同齡正常對(duì)照兒童CDR3譜型變化，為明確各亞家族多樣性受限情況，我們對(duì)各CDR3譜型圖進(jìn)行復(fù)雜性評(píng)分，評(píng)分小于4分的亞家族即為TCRVB多樣性受限;對(duì)總的外周血細(xì)胞及分選的各群細(xì)胞的平均復(fù)雜性評(píng)分、受限頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2.采用高通量測(cè)序(Highthroughput sequencing

5、，HTS)方法，對(duì)12例WAS患者和12例同齡正常對(duì)分選所得的初始CD4+、CD8，記憶CD4+T細(xì)胞的CDR3區(qū)域進(jìn)行深度測(cè)序，運(yùn)用辛普森指數(shù)(Simpsonindex，Ds)和香濃威納指數(shù)(Shannon Weiner index，H')評(píng)估各群T細(xì)胞的TCR多樣性，用生物信息學(xué)方法分析不同樣品間共有和特異的TCRCDR3序列。
　　結(jié)果:
　　1.運(yùn)用CDR3掃描譜型分析方法，我們研究了7例WAS患兒(P1-P7)和同

6、齡對(duì)照外周總T細(xì)胞TCR多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的TCR CDR3譜型圖多表現(xiàn)為6個(gè)以上的呈鐘形分布的峰圖，提示其為多克隆表達(dá);而WAS病人眾多亞家族的峰圖表現(xiàn)為峰數(shù)減少，呈非鐘形分布的受限峰圖，提示其T細(xì)胞呈單克隆或寡克隆擴(kuò)增（圖1.3A）。為量化評(píng)估TCR受限程度，我們對(duì)每個(gè)研究對(duì)象的23個(gè)亞家族均進(jìn)行復(fù)雜分?jǐn)?shù)評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病人組的平均復(fù)雜分?jǐn)?shù)顯著低于對(duì)照組的平均復(fù)雜分?jǐn)?shù)(圖1.3B)。
　　2.為明確病人TCR多樣性受限來(lái)源，

7、我們將6例病人和對(duì)照的外周血進(jìn)行分選，得到高純度的CD4+和CD8+T細(xì)胞，運(yùn)用CDR3掃描譜型分析方法評(píng)估各亞群的TCR多樣性受限情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病人CD4+T細(xì)胞的多數(shù)亞家族的峰圖呈鐘形分布，而CD8+T細(xì)胞多數(shù)亞家族的峰圖呈受限表現(xiàn)（圖1.5A）。與同齡對(duì)照相比，病人組的CD4+，CD8+T細(xì)胞的平均復(fù)雜分?jǐn)?shù)均顯著降低，這提示W(wǎng)AS病人的CD4+，CD8+T細(xì)胞TCR多樣性均明顯受限((CD4，P=.002; CD8，P=.002

8、;圖1.5B)。
　　3.為進(jìn)一步明確WAS病人TCR多樣性受限來(lái)源，我們分選得到了分別來(lái)自12例WAS病人和同齡對(duì)照的高純度的初始和記憶CD4+，CD8+T細(xì)胞亞群，并運(yùn)用CDR3掃描譜型分析方法評(píng)估各個(gè)亞群的TCR受限情況。研究發(fā)現(xiàn)，同齡對(duì)照組的初始CD4+，初始CD8+，記憶CD4+T細(xì)胞亞群多數(shù)亞家族的峰圖呈鐘形分布，而記憶CD8+T細(xì)胞多數(shù)亞家族的峰圖則是受限表現(xiàn);而在WAS病人組，只有初始CD4+T細(xì)胞多數(shù)亞家族的TC

9、R峰圖呈鐘形分布，而初始CD8+，記憶CD4+，記憶CD8+TCR峰圖均受限（圖1.6A）。與同齡對(duì)照相比，病人組的記憶CD4+，初始CD4+，初始CD8+T細(xì)胞的平均復(fù)雜分?jǐn)?shù)均顯著降低，這提示W(wǎng)AS病人的記憶CD4+，初始CD4+，初始CD8+T細(xì)胞TCR多樣性均受限（圖1.6B）。
　　4.我們對(duì)WAS病人和同齡對(duì)照的23個(gè)亞家族的受限頻率進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在外周總T細(xì)胞中，WAS病人組的受限頻率中位數(shù)是17.39％(0-47

10、.83％)，對(duì)照組為4.35％(0-17.39％)，兩組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而由于外周總T細(xì)胞由多群細(xì)胞構(gòu)成，不同細(xì)胞亞群的受限程度的不同可能掩飾總的受限情況。因此，我們對(duì)不同T細(xì)胞亞群的受限頻率進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病人組CD4+T, CD8+T細(xì)胞亞群的受限頻率均顯著低于同齡對(duì)照組這兩個(gè)細(xì)胞亞群的受限頻率(CD4+T,P=.03;CD8+T細(xì)胞，P=.01)。為明確初始和記憶T細(xì)胞亞群與TCR受限的關(guān)系，我們進(jìn)一步分析了初始和記憶CD4+，

11、CD8+T細(xì)胞亞群的受限頻率。研究發(fā)現(xiàn)，跟同齡對(duì)照相比，病人組的初始CD8+T細(xì)胞和記憶CD4+T細(xì)胞的受限頻率均顯著高于同齡對(duì)照組（見(jiàn)圖1.7）。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)WAS病人的初始CD8+T細(xì)胞和記憶CD4+T細(xì)胞亞群的TCR多樣性是顯著受限的。
　　5.運(yùn)用高通量測(cè)序方法，對(duì)WAS病人及同齡對(duì)照分選的初始CD4+、CD8，記憶CD4+T細(xì)胞的CDR3區(qū)域進(jìn)行深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)，WAS患者和同齡對(duì)照間不同細(xì)胞亞群的測(cè)序讀數(shù)和CDR3氨基

12、酸序列數(shù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，病人組的記憶CD4+T細(xì)胞亞群的有效讀數(shù)，初始CD8+T細(xì)胞亞群獨(dú)特的肽段讀數(shù)均顯著低于同齡對(duì)照組。病人組的三個(gè)細(xì)胞亞群的Ds和H'均低于對(duì)照組，這表明病人組的TCR多樣性低于同齡對(duì)照組;然而，跟同齡對(duì)照組相比，WAS病人的細(xì)胞亞群中只有記憶CD4+T和初始CD8+T細(xì)胞亞群的H'顯著低于同齡對(duì)照組(P=.003，P=.022;圖2.1A)。
　　結(jié)論:在國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)WAS基因突變可選擇性影響初始C

13、D8+T細(xì)胞及記憶CD4+T細(xì)胞TCRVB庫(kù)多樣性的形成，可能與WAS病人對(duì)疫苗、感染的記憶應(yīng)答減低有關(guān)。
　　第三部分 DOCK8免疫缺陷綜合征T細(xì)胞受體多樣性研究
　　DOCK8免疫缺陷綜合癥(Dedicator of cytokinesis8immunodeficiency syndrome，DIDS; OMIM243700)是一種以皮膚病毒感染，過(guò)敏，易患腫瘤，淋巴細(xì)胞減少癥， IgE增多，嗜酸細(xì)胞增多等為特征的聯(lián)合

14、免疫缺陷疾病。該疾病是由9號(hào)染色體上的DOCK8基因突變導(dǎo)致。DOCK8基因編碼DOCK8蛋白，屬于DOCK180蛋白超家族，為一種新的針對(duì)Rho家族GTP酶的鳥嘌呤核苷轉(zhuǎn)錄因子(guanine nucleotide exchange factor, GEF)，DOCK180-相關(guān)的鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)錄因子在多種細(xì)胞表面受體的下游起作用，誘發(fā)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排，板狀偽足形成，細(xì)胞遷移，整合蛋白介導(dǎo)的粘附、吞噬、細(xì)胞融合、細(xì)胞極化、以及突觸

15、形成等生物學(xué)過(guò)程。DIDS死亡率較高，在報(bào)道的32例已確診病人中，7例在6-21歲間死亡。由于DOCK8蛋白表達(dá)于全身多個(gè)臟器和組織，因此DOCK8突變對(duì)機(jī)體的影響廣泛。
　　DIDS病人可表現(xiàn)出多種免疫系統(tǒng)異常。其中最顯著的發(fā)現(xiàn)為淋巴細(xì)胞減少癥和抗體異常。DIDS本質(zhì)上為聯(lián)合免疫缺陷，患者反復(fù)罹患病毒感染與T細(xì)胞功能缺陷關(guān)系密切，足夠豐富的T細(xì)胞庫(kù)為機(jī)體針對(duì)數(shù)量巨大的病原體感染提供物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，與WASp同屬細(xì)胞骨架重構(gòu)過(guò)程中

16、的重要分子，DOCK8基因突變是否也會(huì)選擇性影響不同T細(xì)胞亞群的TCR多樣性尚未明確。
　　目的:研究DIDS外周血總T細(xì)胞，分選的CD4+、CD8+T細(xì)胞，分選的初始和記憶CD4+、CD8+T細(xì)胞受體β鏈可變區(qū)(TCR Vβ)受體譜限制性改變的程度及模式。
　　方法:收集4例DIDS患兒及6例同齡正常對(duì)照新鮮外周血標(biāo)本，分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，采用流式細(xì)胞術(shù)分選CD4+、CD8+T細(xì)胞，進(jìn)一步分選足夠數(shù)量的初始及記憶C

17、D4+、CD8+T細(xì)胞，從總的外周血及分選的各群細(xì)胞中立即提取RNA，并合成cDNA。
　　1.采用互補(bǔ)決定區(qū)3掃描譜型分析方法分析比較DIDS患兒及同齡正常對(duì)照CDR3譜型變化，對(duì)各CDR3譜型圖進(jìn)行復(fù)雜性評(píng)分，評(píng)分小于4分的亞家族即為TCRVB多樣性受限;對(duì)總的外周血細(xì)胞及分選的各群細(xì)胞的平均復(fù)雜性評(píng)分、受限頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2.采用HTS方法，對(duì)2例DIDS患兒兩次分選的多個(gè)T細(xì)胞亞群與12例WAS患兒，和12

18、例同齡正常對(duì)照分選所得的初始CD4+、CD8，記憶CD4+T細(xì)胞的CDR3區(qū)域進(jìn)行深度測(cè)序，運(yùn)用Ds、H'和D50評(píng)估各群T細(xì)胞的TCR多樣性。
　　結(jié)果:與年齡匹配的正常對(duì)照相比，
　　1.在總的外周血細(xì)胞中，4例DIDS患兒的TCRVB多樣性較之6例正常對(duì)照有明顯受限，受限頻率有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=.01;見(jiàn)圖3.1C)。
　　2.對(duì)2例DIDS患兒分選的CD4+，CD8+T細(xì)胞，以及初始、記憶CD4+和CD8+T

19、細(xì)胞的TCR多樣性分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DIDS患者的CD4+T細(xì)胞，初始CD4+和記憶CD4+T細(xì)胞的CDR3譜型圖多表現(xiàn)為6個(gè)以上的呈鐘形分布的峰圖，提示其為多克隆表達(dá);而DIDS患者的CD8+T細(xì)胞，初始CD8+和記憶CD8+T細(xì)胞的許多亞家族譜型圖表現(xiàn)為峰數(shù)減少，呈非鐘形分布的受限峰圖，提示其T細(xì)胞呈單克隆或寡克隆擴(kuò)增（圖3.2A）。對(duì)各亞家族計(jì)算其平均復(fù)雜性分?jǐn)?shù)，在P3，P4，DIDS病人的初始及記憶CD8+T細(xì)胞的平均復(fù)雜分?jǐn)?shù)顯

20、著低于其初始和記憶CD4+T細(xì)胞的平均復(fù)雜分?jǐn)?shù)（圖3.2B）。DIDS病人的初始CD4、記憶CD4和初始CD8 T細(xì)胞亞群的平均復(fù)雜分?jǐn)?shù)和受限頻率與正常對(duì)照組及WAS病人相比，僅有初始CD8 T細(xì)胞亞群的平均復(fù)雜分?jǐn)?shù)顯著低于正常對(duì)照，受限頻率顯著高于正常對(duì)照(P＜.001，P＜.001，圖3.2,C，D)，其余亞群無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這證實(shí)了DOCK8基因突變主要導(dǎo)致初始CD8+T細(xì)胞的TCR多樣性受限。
　　3.運(yùn)用高通量測(cè)序方法

21、，對(duì)2例DIDS忠兒總T細(xì)胞，分選的CD4+、CD8，初始和記憶CD4+、CD8+T細(xì)胞的CDR3區(qū)域進(jìn)行深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)，DIDS患者的總測(cè)序讀數(shù)和有效讀數(shù)在各細(xì)胞亞群間無(wú)明顯差異，而CD8+、初始CD8+、記憶CD8+T細(xì)胞亞群的總的克隆數(shù)、特異肽段數(shù)和D50明顯低于CD4+、初始CD4+、記憶CD4+T細(xì)胞（圖3.3)，這提示DIDS病人的CD8+、初始CD8+、記憶CD8+T細(xì)胞TCR多樣性受限。
　　4.研究發(fā)現(xiàn)DIDS病人

22、組的三個(gè)細(xì)胞亞群的H'、Ds和D50均低于對(duì)照組（圖3.4），這表明DIDS病人的TCR多樣性低于同齡對(duì)照組。跟同齡對(duì)照組相比，DIDS病人的細(xì)胞亞群中初始CD8+T細(xì)胞亞群的H'和D50均顯著低于同齡對(duì)照組（P＜.0001， P=.03;圖3.4），其他亞群無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示DIDS病人的初始CD8+T細(xì)胞亞群的TCR多樣性顯著減低。與WAS病人相比， DIDS病人僅有初始CD8+T細(xì)胞的H'、Ds和D50減低，而初始CD4和記憶CD

23、4 T細(xì)胞亞群的H'、Ds和D50都高于WAS病人，這提示DIDS病人的初始CD8+T細(xì)胞TCR多樣性受限程度比WAS受限程度嚴(yán)重。
　　5.運(yùn)用高通量測(cè)序方法，對(duì)1例DIDS患兒(P3)第二次隨訪的總PBMC，分選的CD3、CD4+、CD8+、初始和記憶CD4+、CD8+T細(xì)胞的CDR3區(qū)域進(jìn)行深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)，DIDS患者的總測(cè)序讀數(shù)和有效讀數(shù)在各細(xì)胞亞群間無(wú)明顯差異，而總PBMC、CD3+T細(xì)胞的總的克隆數(shù)、特異肽段數(shù)和D50，