原發(fā)免疫缺陷病DOCK8缺陷綜合征及IKBKB缺陷疾病的發(fā)病機制探討.pdf

1、第一部分 DOCK8缺陷狀態(tài)下濾泡輔助 T細胞產(chǎn)生 IL-21調(diào)節(jié) IgE的機制研究
　　背景：高 IgE綜合征(Hyper-IgE syndrome, HIES)是一組常染色體遺傳的原發(fā)性免疫缺陷病，其中常染色體隱性遺傳(AR)的DOCK8免疫缺陷綜合癥(Dedicator of cytokinesis8 immunodeficiency syndrome, DIDS;OMIM243700)是一種以特應性皮炎、反復、慢性皮膚病毒

2、感染和呼吸道感染癥狀、血清 lgE升高和嗜酸性粒細胞增多為特征的原發(fā)性免疫缺陷疾病。DOCK8基因定位于人類9號染色體p24.3，其編碼的 DOCK8蛋白可激活Rho-GTP酶，從而調(diào)節(jié)諸多細胞功能，尤其是肌動蛋白細胞骨架調(diào)控、影響細胞遷移活動。DOCK8缺陷患者罹患聯(lián)合免疫缺陷，但B細胞介導的抗體缺陷最為突出，其中尤以IgE水平急劇升高較為明顯，目前機制未知。
　　目的:分析中國的DOCK8缺陷綜合征患兒臨床表現(xiàn)及免疫功能，采用

3、臨床樣本與DOCK8-KO小鼠模型探究DOCK8蛋白缺陷對IgE水平的影響及其機制。
　　方法：采用高通量測序及流式細胞術(shù)對疑似高IgE綜合征的患兒進行診斷，確立DOCK8缺陷診斷后進行淋巴細胞免疫功能評估，分析患兒及健康同齡對照外周血濾泡輔助 T細胞數(shù)量和功能改變，以及其相關(guān)功能分子 IL-21水平，實時熒光定量檢測 Bcl-6及Blimp-1 mRNA表達。運用TALEN技術(shù)建立DOCK8-KO小鼠模型并對其免疫功能進行評估，

4、分析濾泡輔助 T細胞數(shù)量功能改變，以及其相關(guān)功能分子 ICOS、PD-1、Bcl-6及 IL-21水平，對DOCK8-KO小鼠進行 IL-21替代治療并觀察其對免疫功能的修復效應。進一步構(gòu)建OVA誘導哮喘DOCK8-KO小鼠模型并對其進行IL-21補充治療，解析其治療機制。
　　結(jié)果：
　　1.7例DOCK8免疫缺陷患兒，2男5女，高IgE綜合征NIH評分均高于40分，表現(xiàn)為反復頑固的病毒感染，肺炎，血清 IgE異常增高和嗜

5、酸性粒細胞增多等現(xiàn)象。針對DOCK8單基因的高通量測序分析顯示7例患兒發(fā)生不同程度的大片段缺失突變、移碼突變或錯義突變，均為尚未報道過的新發(fā)突變。其中 P1患兒為19-48號外顯子雜合性大片段缺失并伴有移碼突變（ c.5842 delG, c5843C>A p.A1948fsX1953），P2患兒11號外顯子純合性缺失，12-33號外顯子雜合性缺失，P3-4患兒為移碼突變（c.3152delG p.S1051fsX1093）和錯義突變（

6、c.5175G>C p.E1725D），P5患兒為2號外顯子純合性缺失，1號，3-39號外顯子雜合性缺失，P6患兒為7號外顯子純合性缺失，8-10號外顯子雜合性缺失，P7患兒為移碼突變（c.1278-1279 delTG p.V427fsX435）。7例患兒完成流式細胞術(shù)及Western檢測，外周血單個核細胞均無DOCK8蛋白表達?；純和庵苎狢D4+T細胞、記憶B細胞和記憶T細胞均有不同程度降低。T細胞刪除環(huán)（TRECs）、淋巴細胞增殖

7、水平和NK細胞的細胞毒殺傷功能均明顯低于正常同齡兒童。外周血調(diào)節(jié)性B細胞水平低下，而調(diào)節(jié)性T細胞，CD4+T細胞產(chǎn)生細胞因子IL-17、IL-4及IFN-γ水平均正常。DOCK8患兒濾泡輔助T細胞占CD4+T細胞比率與正常人相比無統(tǒng)計學差異，但絕對值卻明顯低于正常對照。尤其是Tfh細胞分泌的IL-21明顯下降。
　　2.（1）運用TALEN技術(shù)建立DOCK8-KO小鼠，DOCK8-KO小鼠較 WT小鼠的血清 IgE、血液及脾臟中的

8、 IgE＋B細胞有升高趨勢，并有統(tǒng)計學差異。DOCK8-KO小鼠的濾泡輔助T細胞相關(guān)功能分子出現(xiàn)不同程度的下降，其中細胞因子IL-21水平下降極為明顯，Tfh細胞分化的主要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6，以及Tfh細胞的功能分子PD-1、ICOS水平均不同程度降低。
　　（2）采用傳統(tǒng)劑量四分之一的低劑量 OVA成功誘導DOCK8-KO小鼠哮喘模型，模型小鼠出現(xiàn)明顯的肺功能異常，血清 IgE水平升高，嗜酸性粒細胞增多等過敏特征。OVA誘導

9、的DOCK8-KO及WT小鼠IgE＋B細胞水平均有升高現(xiàn)象，但前者升高的水平是后者的數(shù)倍，其中血清總IgE及OVA特異性IgE水平升高尤為明顯。經(jīng)OVA誘導的DOCK8-KO小鼠IL-21水平隨之進一步下降，而經(jīng) OVA誘導的 WT小鼠則沒有明顯改變。另外， OVA誘導的DOCK8-KO小鼠脾臟記憶性Tfh細胞，Tfh細胞分化的主要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6，以及Tfh細胞的功能分子PD-1、ICOS均出現(xiàn)明顯降低。
　　3.（1）使

10、用重組小鼠 IL-21細胞因子（20ng/d×3-6天）對DOCK8-KO小鼠進行替代治療，發(fā)現(xiàn)KO小鼠血清IgE水平幾乎能夠回復到正常水平，脾臟 Tfh細胞及其分化的主要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6，以及Tfh細胞的功能分子PD-1和ICOS均能不同程度的回升至接近正常水平，治療效應十分明顯。
　　（2）采用IL-21治療OVA誘導的小鼠模型，WT小鼠的IgE水平雖有回復，但總體治療效果不如DOCK8-KO小鼠明顯。經(jīng)OVA誘導的DO

11、CK8-KO小鼠經(jīng)過IL-21治療其IgE水平能夠回復到正常水平，并且Tfh細胞及其主要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6，以及Tfh細胞的功能分子PD-1，ICOS均能不同程度的回升至正常水平。
　　結(jié)論：DOCK8缺陷引起Tfh細胞發(fā)育分化障礙，IL-21分泌降低，可能是導致B細胞對過敏原反應失控，產(chǎn)生大量功能性IgE的根本原因。
　　第二部分 IKKβ缺陷對 NF-κB入核的影響
　　背景：IKBKB基因突變是一種特殊的聯(lián)合

12、免疫缺陷病，以反復細菌、病毒、真菌感染為主要表現(xiàn)，大部分病人會出現(xiàn)不同程度鵝口瘡、支氣管炎及肺炎，并伴有慢性腹瀉、生長發(fā)育遲緩、腦出血、癲癇、臍炎、臍帶脫落延遲等現(xiàn)象。IKBKB基因定位于人類8號染色體p11.2，其編碼的IKKβ蛋白是IκB kinase的亞單位之一，主要參與NF-κB通路激活過程，活化的IKK磷酸化IκBα（NF-κB的抑制劑），磷酸化的IκBα不斷降解，使其對NF-κB的抑制功能減弱，后者則可以自由出入細胞核并激活

13、參與炎癥及免疫反應的各種基因。
　　目的：分析一例 IKBKB突變患兒臨床表現(xiàn)、蛋白表達、基因突變及免疫功能。探討395位點氨基酸磷酸化對NF-κB入核影響及通路功能的影響及機制。
　　方法：患兒男，17歲，生后2月齡開始出現(xiàn)反復呼吸道感染，腹瀉及低體重。采用高通量測序發(fā)現(xiàn)基因突變，并用一代測序驗證，采用流式細胞術(shù)及免疫印跡法檢測IKKβ蛋白。采用流式細胞術(shù)分析淋巴細胞功能，EMSA方法檢測核內(nèi)NF-κB水平。制備395位點

14、定點變異細胞系，以去除該位點磷酸化，探討其對IKKβ蛋白穩(wěn)定性的影響機制。
　　結(jié)果：高通量測序顯示 IKBKB基因發(fā)生錯義突變（c.1183T>C,p.Y395H），為尚未報道的新發(fā)突變。一代測序驗證確認為該位點突變，流式細胞術(shù)及免疫印跡法均未能檢測到 IKKβ蛋白表達。免疫功能評估中發(fā)現(xiàn)患兒記憶B細胞極度低下，調(diào)節(jié)性T細胞缺如，淋巴細胞增殖水平明顯受損。調(diào)節(jié)性B細胞升高，而CD4+T細胞表達細胞因子IL-17、IL-4、IL-

15、21及IFN-γ均處于正常下限，NK細胞的細胞毒殺傷功能及 TCRVβ多樣性正常。患兒細胞核內(nèi)NF-κB蛋白較正常人明顯降低，提示基因突變導致進入細胞核的NF-κB水平減少。進一步發(fā)現(xiàn)395位點突變導致磷酸化位點消失后IKKβ降解速率增快，蛋白穩(wěn)定性下降。
　　結(jié)論：確診1例極為罕見的 PID病例——IKBKB缺陷，為全球范圍內(nèi)報道的第10例患兒。IKKβ的395位點發(fā)生的錯義突變?yōu)樯形磮蟮肋^的新發(fā)突變。首次闡明該位點是 IKKβ