Obestatin對(duì)慢性心力衰竭大鼠腎臟水通道蛋白2的長(zhǎng)時(shí)調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、慢性心力衰竭是多種心血管疾病的終末階段，其中常見(jiàn)的原因是冠心病，特別是心肌梗死。慢性心衰預(yù)后較差，有統(tǒng)計(jì)表明整體生存率比惡性腫瘤更低?；颊叩纳尜|(zhì)量逐年下降、醫(yī)療成本逐漸升高，引起社會(huì)的廣泛關(guān)注。水潴留是心衰的重要病理生理機(jī)制，針對(duì)水潴留的利尿是心衰規(guī)范化治療的基石。臨床上最常用的袢利尿劑能選擇性地阻斷分布在髓袢升支管腔側(cè)質(zhì)膜上的Na+-K+-2CI-共轉(zhuǎn)運(yùn)子，抑制機(jī)體對(duì)氯化鈉的重吸收，產(chǎn)生強(qiáng)大的利尿作用，但其應(yīng)用也有一定的局限性。利鈉

2、治療繼發(fā)的低鈉血癥是影響心衰遠(yuǎn)期預(yù)后的危險(xiǎn)因素，部分患者出現(xiàn)的利尿劑抵抗是臨床常見(jiàn)的難題。因此，新的水代謝調(diào)控靶點(diǎn)和高效安全、特異性強(qiáng)的利尿藥物研究一直是學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　水通道蛋白2(Aquaporin2，AQP2)分布于腎臟集合管主細(xì)胞的管腔頂質(zhì)膜和胞漿的囊泡內(nèi)，是調(diào)控集合管水通透性的關(guān)鍵通道蛋白，主要承擔(dān)集合管腔水的重吸收和原尿濃縮的功能。AQP2在管腔頂質(zhì)膜的分布及合成上調(diào)，進(jìn)而增加水重吸收，是心力衰竭水潴留的最重要

3、病理生理機(jī)制之一。針對(duì)調(diào)控AQP2蛋白開(kāi)發(fā)的新型利尿劑顯示出眾多優(yōu)越性，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
　　肥胖抑制素obestatin是2005年由斯坦福大學(xué)張鍵博士等人發(fā)現(xiàn)的一種由23個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，經(jīng)酰胺化修飾成為生物活性形式，在調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)功能、體重變化、糖脂代謝、血管內(nèi)皮功能等方面有廣泛作用。中樞側(cè)腦室給予obestatin可直接影響口渴中樞，減少機(jī)體的水?dāng)z入，同時(shí)通過(guò)抑制下丘腦的精氨酸加壓素(AVP)的合成和釋放，下調(diào)腎

4、臟對(duì)水的重吸收。心力衰竭時(shí)外周循環(huán)obestatin水平升高，由于循環(huán)中obestatin不能通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞，那么外周循環(huán)obestatin對(duì)腎臟水重吸收是否有調(diào)節(jié)作用值得進(jìn)一步研究。
　　目的:目前在慢性心力衰竭機(jī)制研究中，關(guān)于obestatin和AQP2的作用鮮有報(bào)道。本課題旨在通過(guò)在體和體外實(shí)驗(yàn)，觀察obestatin對(duì)水代謝和腎臟內(nèi)髓AQP2的長(zhǎng)時(shí)調(diào)控作用，通過(guò)基因芯片篩選差異表達(dá)基因以及基因沉默技術(shù)來(lái)分析其可能的調(diào)

5、控機(jī)制。
　　方法:利用臨床常用器材，設(shè)計(jì)自制經(jīng)口氣管插管的定位防逆流裝置和尾靜脈穿刺用途的四聯(lián)固定器，并在預(yù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試評(píng)估。采用開(kāi)胸結(jié)扎前降支的方法構(gòu)建大鼠急性心肌梗死模型，6周后通過(guò)心臟超聲來(lái)篩選EF值≤45％的大鼠作為心力衰竭模型，隨機(jī)納入造模空白組、dDAVP組、V2受體拮抗劑組、obestatin高劑量組、obestatin低劑量組、NA-obestatin組、obestatin抗血清組等7組，加上假手術(shù)組共8組。分

6、別尾靜脈注射生理鹽水、dDAVP、OPC31260、obestatin(200ug/kg)、obestatin(100ug/kg)、NA-obestatin、obestatin抗血清，連續(xù)注射14天。第15天（造模后第8周末）為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)并取大鼠腎臟內(nèi)髓。實(shí)驗(yàn)全程定期測(cè)量尿量、體重，干預(yù)前后分別行心臟彩超檢查及留取血尿樣本。使用ELISA方法檢測(cè)血BNP和血AVP水平，使用熒光定量PCR檢測(cè)Aqp2基因表達(dá)，免疫組化和western bl

7、otting相對(duì)定量AQP2蛋白在腎臟內(nèi)髓的表達(dá)情況。體外培養(yǎng)mIMCD3細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至70％融合狀態(tài)，無(wú)血清培養(yǎng)基空白12h后，分別給予不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)(6h、12h、24h、36h、48h，10-7mmol/L的obestain)和不同干預(yù)措施(PBS、10-7mmol/L的obestatin、0.5×10-7mmol/L的obestatin、NA-obestatin、dDAVP、OPC31260、obestatin抗血清)的刺激，2

8、4h后分別提取RNA和蛋白，通過(guò)定量PCR和western blotting來(lái)檢測(cè)AQP2基因和蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)基因芯片對(duì)obestatin和PBS分別干預(yù)后的mIMCD3細(xì)胞mRNA進(jìn)行差異表達(dá)基因篩查，通過(guò)生物信息學(xué)分析推測(cè)可能的調(diào)控機(jī)制并選取73個(gè)感興趣的基因進(jìn)行real-time qPCR驗(yàn)證。從驗(yàn)證后的基因中選取與水代謝密切相關(guān)的Pparg、V2r、Gpr39三個(gè)靶基因進(jìn)行特異性敲減，觀察obestatin調(diào)控AQP2表達(dá)

9、的變化。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建大鼠心梗后慢性心衰模型，成模率為51.16％。造模后8周，心衰模型各組間LVIDd、LVIDs、LVVold、LVVols、EF％、FS％等心功能指標(biāo)以及血尿電解質(zhì)組間比較無(wú)明顯差異。Obestatin高劑量組與干預(yù)前相比24h尿量明顯增加（75.18±8.51vs.40.77±5.49mL/kg，P＜0.001）。Obestatin高劑量組與造?？瞻捉M相比，血漿BNP濃度明顯下降(1152.61±99

10、.31vs.1504.54±85.62pg/mL，P＜0.001)，血漿AVP無(wú)明顯變化（12.13±0.74vs.12.41±1.04pg/mL，P＞0.05）。Real-time qPCR及免疫組化、western blotting顯示腎內(nèi)髓AQP2基因和蛋白表達(dá)與造?？瞻捉M比較均下降。體外培養(yǎng)的IMCD3細(xì)胞經(jīng)obestatin在不同時(shí)間點(diǎn)刺激后，AQP2基因和蛋白的表達(dá)量水平波動(dòng)基本一致，與對(duì)照組(0h)相比，6h、12h、24

11、h、36h和48h時(shí)間點(diǎn)AQP2的表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，在6h-24h區(qū)間內(nèi)，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，其下降趨勢(shì)越明顯;但是36h后，其下降趨勢(shì)呈現(xiàn)回升現(xiàn)象。體外培養(yǎng)的mIMCD3細(xì)胞分別給予不同措施刺激24h后，與假手術(shù)組相比，obestatin高劑量組、obestatin低劑量組以及OPC組AQP2基因和蛋白的表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，與obestatin高劑量組相比，抗血清組AQP2基因和蛋白的表達(dá)量顯著升高。在obe

12、statin刺激后的mIMCD3細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因主要有Pparg、Aqp2、V2r、Fgf23、Myo1f、Slc8a1，可能參與長(zhǎng)時(shí)調(diào)控的信號(hào)通路有FGF信號(hào)通路。敲減Pparg、V2r基因能使mIMCD3細(xì)胞的AQP2表達(dá)下調(diào)，同時(shí)給予obestatin刺激24h后，下調(diào)幅度更為顯著。敲減Gpr39基因?qū)IMCD3細(xì)胞的AQP2表達(dá)無(wú)明顯影響，但同時(shí)給予obestatin刺激后，能顯著削弱obestatin對(duì)V2R

13、、PPARG、AQP2的下調(diào)效應(yīng)。
　　結(jié)論:在體實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了obestatin能下調(diào)腎臟內(nèi)髓AQP2表達(dá)，在體實(shí)驗(yàn)還觀察到利尿作用及心衰的生化指標(biāo)好轉(zhuǎn)?；蛐酒Y查結(jié)果的生物信息學(xué)分析及定量PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)obestatin通過(guò)V2R與PPARG兩條信號(hào)通路來(lái)下調(diào)IMCD3細(xì)胞的Aqp2基因表達(dá)，Myo1f、Slc8a1基因可能參與鈣調(diào)蛋白結(jié)合和細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合等分子生物學(xué)功能的調(diào)控。利用shRNA技術(shù)特異性敲減Pparg