重組噬菌體靶向探針在動(dòng)脈血栓近紅外活體成像中的應(yīng)用.pdf

1、目的:血栓性疾病是臨床常見病，嚴(yán)重危害著人類的健康及生命。血管一旦形成血栓，便可使累及的血管狹窄甚至閉塞，造成相應(yīng)的器官或者組織缺血而致功能障礙、器官或者組織壞死，往往造成不可逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重后果，甚至是死亡。血栓形成是中國前三位的致死性心血管病——心臟病、腦卒中和靜脈血栓栓塞癥(VTE)的共同發(fā)病機(jī)制。尤其是肺血栓栓塞癥致死率高，臨床癥狀多樣，缺乏特異性，臨床上漏診與誤診情況嚴(yán)重，及時(shí)、準(zhǔn)確進(jìn)行診斷至關(guān)重要。目前用于診斷血栓的檢測方法非常多

2、，但是超聲、CT、MRI、DSA、SPECT等檢測方法都有各自的缺陷。因此尋找一種經(jīng)濟(jì)的、敏感的手段變得十分迫切。前期研究表明，P1Cm（專利號ZL201110341296.X，結(jié)締組織生長因子小肽）能夠靶向結(jié)合血小板表面高表達(dá)蛋白αⅡbβ3，我們試圖用噬菌體展示技術(shù)將P1Cm肽展示在噬菌體表面，以噬菌體作為納米載體制備近紅外探針用于血栓的靶向成像研究。
　　第一部分、噬菌體展示載體的構(gòu)建及重組噬菌體的制備
　　方法:利用噬

3、菌體展示技術(shù)，通過基因工程方法對野生噬菌體M13進(jìn)行突變，將目的肽片段插入其中構(gòu)建出重組噬菌體，獲得重組噬菌體;通過ELISA、PCR及基因測序等方法驗(yàn)證構(gòu)建是否成功;同時(shí)，用CCK8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)考察重組噬菌體的細(xì)胞毒性。
　　結(jié)果:通過ELISA、Q-PCR、酶切鑒定、基因測序等方法驗(yàn)證我們成功構(gòu)建了重組噬菌體載體，并引入KpnⅠ和EagⅠ酶切位點(diǎn);通過PEG8000/NaCl沉淀法獲得了高純度重組噬菌體;細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，重組

4、噬菌體對細(xì)胞存活率幾乎沒有影響。
　　結(jié)論:通過噬菌體展示技術(shù)成功構(gòu)建了能展示任意已知肽的噬菌體載體，并通過轉(zhuǎn)化及感染獲得目的重組噬菌體，該噬菌體無明顯細(xì)胞毒作用。
　　第二部分、重組噬菌體與血小板體外結(jié)合研究
　　方法:用FITC及CY5.5標(biāo)記重組噬菌體，純化后得到熒光探針，評估其穩(wěn)定性;用CCK8實(shí)驗(yàn)考察熒光探針的細(xì)胞毒性;將熒光探針分別與血小板共孵育，用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡考察熒光探針與血小板的結(jié)合。<

5、br>　　結(jié)果;標(biāo)記后的重組噬菌體在4周時(shí)間里穩(wěn)定性較好;噬菌體熒光探針對細(xì)胞存活率沒有明顯影響;流式細(xì)胞術(shù)及激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，重組噬菌體熒光探針能夠通過膜表面糖蛋白αⅡbβ3中的β3亞基與血小板特異性結(jié)合，且熒光強(qiáng)度大于熒光素標(biāo)記的P1Cm肽。
　　結(jié)論:成功制備了基于重組噬菌體的靶向納米探針，該探針能與血小板表面的β3亞基特異性結(jié)合。
　　第三部分、重組噬菌體納米探針用于動(dòng)物動(dòng)脈血栓靶向成像的研究
　　方法

6、:利用三氯化鐵誘導(dǎo)建立裸鼠頸動(dòng)脈血栓模型，并將熒光探針經(jīng)尾靜脈注射入動(dòng)物體內(nèi)，利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對血栓部位進(jìn)行近紅外成像;成像結(jié)束離體重要臟器進(jìn)行近紅外成像。將離體的頸動(dòng)脈進(jìn)行HE染色進(jìn)行病理學(xué)檢測，并制作頸動(dòng)脈、心臟、肝臟、腎臟切片與探針雜交，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　結(jié)果:用三氯化鐵可以成功誘導(dǎo)裸鼠頸動(dòng)脈血栓模型;將CY5.5-M13-P1Cm與CY5.5-P1Cm熒光探針經(jīng)尾靜脈注射入小動(dòng)物體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)兩者均能夠?qū)?/p>

7、血栓部位進(jìn)行成像，并且CY5.5-M13-P1Cm探針成像效果優(yōu)于CY5.5-P1Cm;同時(shí)，CY5.5-M13-P1Cm探針成像時(shí)間更久、更穩(wěn)定。熒光雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示，CY5.5-M13-P1Cm及CY5.5-P1Cm探針均可與血栓特異性結(jié)合，但CY5.5-M13-P1Cm探針的熒光信號強(qiáng)度及分布大于CY5.5-P1Cm探針，與在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　結(jié)論:重組噬菌體CY5.5-M13-P1Cm近紅外熒光探針能夠靶向血栓成像，持