自組裝DNA凝膠作為固定化酶載體的應(yīng)用研究.pdf

1、固定化酶技術(shù)是現(xiàn)代生物催化的核心技術(shù)。通過酶固定有望提高酶的催化效率，提高回收率，延長酶的保質(zhì)期，為酶的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。固定化酶技術(shù)關(guān)鍵在于新型功能載體材料的研究與發(fā)展。DNA凝膠具有DNA的序列可編程性、便于合成與修飾，能夠可控組裝，并且具有較好的生物相容性，可降解性以及高的滲透性。這些優(yōu)點(diǎn)賦予了DNA凝膠作為載體材料在蛋白質(zhì)裝載、藥物裝載與釋放、胞外蛋白生產(chǎn)、DNA免疫治療等領(lǐng)域潛在的應(yīng)用前景。近年來DNA凝膠已經(jīng)

2、被廣泛的用于固定和裝載客體分子，比如酶、蛋白質(zhì)和納米顆粒以及微米級的細(xì)胞。本文利用DNA凝膠可控組裝等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展了DNA-蛋白質(zhì)雜合凝膠，實(shí)現(xiàn)了生物酶的固定;并且構(gòu)建了基于DNA凝膠的生物酶級聯(lián)反應(yīng)體系，具體內(nèi)容如下:
　　1.基于DNA超級三明治雜交反應(yīng)和鏈霉親和素生物連接作用，構(gòu)建了DNA-蛋白質(zhì)雜合凝膠，實(shí)現(xiàn)了酒精氧化酶(AOx)的生物固定，提高了AOx的生物穩(wěn)定性。首先通過超級三明治雜交反應(yīng)形成具有周期性生物素的雜交雙鏈，

3、加入鏈霉親和素以及客體生物分子AOx，基于同步組裝方法，構(gòu)建了DNA-蛋白質(zhì)凝膠，實(shí)現(xiàn)了AOx的有效包被。酶的裝載效率是42％，負(fù)載容量是18mg AOx/g凝膠。形成的雜合凝膠直徑6.7±2.1μm，類似于花朵狀，具有多孔的三維凝膠結(jié)構(gòu)。裝載在DNA-蛋白質(zhì)凝膠中AOx與血清培育24h后，保持78％生物催化活性?；贒NA-蛋白質(zhì)凝膠表面的生物素位點(diǎn)和本身帶負(fù)電的特性，可以直接固定于鏈霉親和素修飾的96孔板以及氨基正電化的玻片上，實(shí)現(xiàn)

4、了基于凝膠的AOx酶表面固定。在55℃加熱，與有機(jī)試劑DMSO培育，5次反復(fù)凍融的實(shí)驗(yàn)條件下，裝載在DNA-蛋白質(zhì)凝膠中的AOx表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的穩(wěn)定性。該方法充分利用DNA程序組裝的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了生物酶的無損物理包被以及表面固定，提高了其生物穩(wěn)定性，有望應(yīng)用于生物酶傳感器等領(lǐng)域。
　　2.基于氯化血紅素(Hemin)誘導(dǎo)組裝的DNA凝膠實(shí)現(xiàn)了氨基化葡萄糖氧化酶(GOx-NH2)的包載，同時構(gòu)建了GOx和G4-Hemin的復(fù)合酶級聯(lián)體

5、系，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化與雙氧水降解的級聯(lián)催化。富含G4序列的DNA通過超級三明治雜交反應(yīng)形成雜交雙鏈，Hemin的加入，基于Hemin與G4序列的結(jié)合作用，觸發(fā)了DNA凝膠的形成。進(jìn)一步加入GOx-NH2，基于靜電作用力實(shí)現(xiàn)了GOx的凝膠包被。酶裝載效率達(dá)到73％。G4-Hemin DNA凝膠體系的過氧化氫催化能力增強(qiáng)增強(qiáng)了26倍。GOx和G4hemin包載于凝膠中，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖催化氧化和H2O2催化降解的反應(yīng)級聯(lián)。該DNA凝膠酶級聯(lián)反應(yīng)