葡聚糖基“智能”納米凝膠的自組裝輔助制備及生物應用研究.pdf

1、納米凝膠是一類由親水性或兩親性高分子組成的納米尺度三維互穿網絡,由于其具有親水性、穩(wěn)定性和可修飾性,在生物顯影,藥物、基因輸運,及生物活性分子檢測等生物醫(yī)用領域具有廣闊的應用前景。本文基于葡聚糖這種生物相容性良好的天然大分子多糖,通過硝酸鈰銨在葡聚糖鏈上引發(fā)多種功能單體的自由基聚合,并誘發(fā)葡聚糖主鏈與功能單體接枝鏈自組裝形成納米聚集體,通過在此過程中加入適當交聯劑,從而將“聚合”、“組裝”、“化學交聯”等過程一步完成,高效制得具有環(huán)境敏

2、感性的“智能”納米凝膠(所得納米凝膠水溶液的濃度可達10 mg/mL以上)。在這種自組裝輔助的一步法(self-assembly assisted method, SAA method)中,設計并使用具有不同功能性的單體或交聯劑,可賦予納米凝膠對pH、光或特定化學物質的環(huán)境敏感性。本研究在對這種自組裝輔助一步法研究的基礎上,對制備的多種功能性納米凝膠進行了結構、組成的表征與分析,并探究了其在藥物輸送、生物標記等領域的生物應用前景。本論文

3、具體開展了以下工作:
　　(1)利用自組裝輔助法通過氫鍵誘導的自組裝合成了葡聚糖-聚丙烯酸納米凝膠(Dex-PAA NGs),并對其合成參數進行了研究,通過控制反應物的投料,可以控制粒子的粒徑及表面電荷;對其進行熒光修飾后,制備得到的熒光納米凝膠(fluorescent nanogels, FNGs)可有效標記脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)。實驗結果表明,粒徑和表面電荷對其進入AD

4、SCs的能力有顯著影響,粒徑小于200 nm的帶電粒子更容易進入細胞。此外,FNGs還可用于標記淋巴管內皮細胞(lymphatic endothelial cells, LECs),且不影響LECs的正常功能,具有很好的生物相容性;經皮下注射后,FNGs由于粒徑較大(~200 nm),不進入血管,而是經淋巴回流進入淋巴管,并在淋巴結部位顯影,標記時間可長達2-4 h,對淋巴結具有一定的選擇性,有十分重要的臨床意義。此外,研究表明,Dex

5、-PAA NGs還可負載淋巴水腫治療藥物—血管內皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C, VEGF-C),在治療淋巴水腫中具有應用潛力。
　　(2)針對腫瘤部位還原性較強、弱酸性的“腫瘤微環(huán)境”,通過引入含二硫鍵的交聯劑二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS),設計并成功制得還原環(huán)境敏感的葡聚糖基納米凝膠,其在還原性環(huán)境中可“解交聯”。并分別通過“氫鍵”和“疏水

6、作用力”這兩種不同的自組裝驅動力,利用自組裝輔助一步法制備了由親水性單體丙烯酸(acrylic acid, AA)或疏水性單體丙烯酸甲酯(methyl acrylate, MA)組成的Dex-SS-PAA NGs和Dex-SS-PMA NGs。在制備方法的研究中,本部分將單體由丙烯酸(acrylic acid, AA)這種聚陰離子單體拓展到丙烯酸甲酯(methyl acrylate, MA)這種疏水單體,從而將SAA法合成葡聚糖基納米凝

7、膠的單體范圍從親水性的陰離子單體推廣到疏水性單體,大大提高了該法的普適性。
　　在成功制備兩類還原環(huán)境敏感的納米凝膠,并對其機理進行研究的基礎上,本部分對兩類納米凝膠的尺度、形貌、還原環(huán)境響應性、特別是抗腫瘤藥物輸送能力進行了研究。動態(tài)光散射(DLS)及靜態(tài)光散射(SLS)研究發(fā)現,兩類納米凝膠均可在還原劑如谷胱甘肽GSH存在下出現一定的粒徑和分子量變化,表現出一定的還原性環(huán)境“解交聯”行為。這種還原性環(huán)境敏感的特點在還原性物質過

8、表達的腫瘤部位的藥物輸送中具有重要意義,因而本研究將這類納米凝膠用于抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素(DOX)的負載,通過酸敏感的腙鍵將DOX負載于兩類納米凝膠中,并對藥物釋放行為及其在宮頸癌及乳腺癌治療中的應用進行了研究。研究表明,Dex-SS-PMA NGs的分布較Dex-SS-PAA NGs窄,且粒徑較小,分散均勻,性能更加穩(wěn)定。Dex-SS-PMA NGs通過腙鍵連接DOX的能力較 Dex-SS-PAA NGs強,載藥量和載藥效率均較高。此

9、外, Dex-SS-PMA-DOX載藥納米凝膠對人宮頸癌 HeLa細胞和人乳腺癌MCF-7細胞的抑制能力較Dex-SS-PAA-DOX強,能夠很好地抑制腫瘤細胞的生長。尤其是當使用還原劑GSH模擬體內環(huán)境時,這類二硫鍵交聯的納米凝膠比碳-碳鍵交聯的載體能夠更好地釋藥并殺死腫瘤細胞,其中對乳腺癌MCF-7細胞的殺傷能力更強一些。后續(xù)的在體抑瘤實驗中,發(fā)現Dex-SS-PMA-DOX保留了DOX的抑制腫瘤生長的能力,同時明顯降低了DOX的毒

10、副作用。這表明Dex-SS-PMA-DOX是一種具有良好應用前景的抗腫瘤藥物輸送體系。
　　(3)選用pH和葡萄糖雙響應的丙烯酰胺基苯硼酸單體,利用疏水力誘導的自組裝作用一步制備了具有pH/葡萄糖雙響應性的葡聚糖-聚丙烯酰胺基苯硼酸納米凝膠(Dex-PAAPBA NGs, DABA NGs)體系。該類納米凝膠葡萄糖響應性的根源在于當二醇類物質(如葡萄糖等)存在時, PAAPBA鏈能夠發(fā)生離解平衡的移動,電離程度增加,親水性增強。研

11、究發(fā)現,DABA NGs在pH=10時具有明顯的葡萄糖響應性,當加入葡萄糖時,其粒徑增大、Zeta電位變負。為進一步證實該納米凝膠的葡萄糖響應性,本部分還選用了一種熒光發(fā)射光譜對于環(huán)境親/疏水性敏感的熒光素單體2-[4-(3-羥基-4-氧代-4H-苯并吡喃-2-基)苯氧基]乙基丙烯酰胺(2-[4-(3-hydroxy-4-oxo-4H-chromen-2-yl)phenoxy] ethylacrylamide,3HF-AM),通過該單體

12、與AAPBA單體的共聚一步制備了具有熒光性能的納米凝膠 FDABA NGs。研究表明,堿性條件下葡萄糖的加入可誘導FDABA NGs水溶液熒光顏色由藍綠色向純藍色轉變。這一“可視化”的葡萄糖敏感行為對于環(huán)境中的葡萄糖檢測非常有利。此外,DABA NGs還能夠通過非共價鍵力負載治療糖尿病的藥物胰島素(insulin, INS),INS從載體中的釋放行為具有一定的葡萄糖響應性,從而為胰島素的葡萄糖敏感釋放提供了可能。
　　綜上所述,本