大豆酯酶的固定化及應(yīng)用研究.pdf

1、由于農(nóng)藥殘留而引起的人畜急、慢性中毒的事件屢見不鮮，食品安全問題引起了高度重視，傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測方法是氣相色譜法和高效液相色譜法，但是此種方法儀器昂貴，操作復(fù)雜，不適合快速檢測。近年來利用乙酰膽堿酯酶開展了很多農(nóng)藥快速檢測的研究，但乙酰膽堿酯酶的提取產(chǎn)量低，成本高，不能滿足當(dāng)前農(nóng)藥殘留檢測的需求，而植物酯酶的成本大大低于乙酰膽堿酯酶，保質(zhì)期也比較長，因此本文以大豆為材料，研究植物酯酶對農(nóng)藥的靈敏性，并且研制了快速檢測酶片，主要結(jié)果如下

2、： 1．大豆酯酶的最佳提取方案為：將大豆樣品按1：5料液比加入到0．3mol/L，pH7．0的磷酸緩沖液中，磁力攪拌120min后，于5000rpm下離心，上清液即為大豆酯酶粗酶液。 2．研究了大豆酯酶的最適反應(yīng)條件：大豆酯酶酶液0．1 mL，底物a－乙酸萘酯0．1mL，pH值為7．5的緩沖液1．9 mL，濃度為0．25mg/mL的顯色劑0．9 mL，反應(yīng)總體積稀釋至10 mL反應(yīng)時間為5min，反應(yīng)溫度為30℃。

3、 3．對26種不同品種大豆進行篩選，確定總酯酶活性最高的通農(nóng)10作為農(nóng)藥快速檢測的品種，考察了大豆酯酶對8種農(nóng)藥的靈敏度，靈敏度為敵敵畏>敵百蟲>對硫磷>甲胺磷>樂果>氧樂果>毒死蜱>西維因。 4．在三種濾紙（定性濾紙、定量濾紙、厚型層析濾紙）材料中篩選出厚型層析濾紙作為固定化酶材料，確定了固定化參數(shù)：酶液濃度為80％，pH值為7．5，固定化溫度為4℃，固定化時間24h，鼓風(fēng)干燥的最佳時間2h，鼓風(fēng)干燥的最佳溫度為40℃。

4、 5．硝酸纖維素膜固定化的最佳參數(shù)：硝酸纖維素膜預(yù)活化條件為：4℃下在0．1mol/LpH7．0的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡48h。固定化酶液濃度為70％，pH值為7．5，固定化溫度為4℃，固定化時間48h，戊二醛濃度為0．25％，不添加牛血清白蛋白。 6．殼聚糖膜固定化的最佳參數(shù)：酶液濃度為80％，pH值為7．5，固定化溫度為4℃，固定化時間24h，戊二醛濃度為0．5％。 7．研究了三種固定化酶的部分酶學(xué)性質(zhì)，并與游離酶

5、特性進比較，結(jié)果表明固定于殼聚糖膜后，最適溫度為30℃，最適pH值為7．0，有良好的重復(fù)使用性能；固定于厚型層析濾紙后，最適最適溫度為30℃，最適pH值為7．5，保存期限比游離酶大大提高，4℃保存一個月相對活力為90．4％；固定于硝酸纖維素膜后，最適溫度為40℃，最適pH值為8．0。 8．通過酶活回收率和酶片實用性比較，確定厚型層析濾紙為大豆酯酶固定化的最佳載體，并用此酶片對8種農(nóng)藥進行檢測，檢測限分別為敵敵畏0．01mg/L，