兩種定向進(jìn)化策略改造單胺氧化酶MAO-N-D5.pdf

1、手性胺在制藥、農(nóng)業(yè)化學(xué)及化工領(lǐng)域中的價(jià)值逐漸升高。它們經(jīng)常被用作拆分劑，各種藥學(xué)活性物質(zhì)和農(nóng)藥的合成子。手性胺的生成包括化學(xué)和生物法兩種，與化學(xué)法相比，酶法合成因其溫和的操作環(huán)境等有利條件而成為環(huán)境友好型的選擇。Aspergillus niger來源的單胺氧化酶經(jīng)過三輪定向進(jìn)化后，篩選出具有高活力、高手性選擇性及廣泛底物譜的突變酶MAO-N-D5。本課題在此基礎(chǔ)上，利用兩種不同定向進(jìn)化策略CASTing和易錯(cuò)PCR，再次改造MAO-N-

2、D5。CASTing過程中，通過分析MAO-N-D5與rac-mexilitine分子對(duì)接結(jié)果，在底物口袋附近選取6個(gè)氨基酸位點(diǎn)，分為三組進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變(A: Phe210/Leu213，B:Met242/Met246，C: Tyr365/Ile367)。第一輪單庫(kù)篩選后，得到兩個(gè)突變酶A-1(F210V/L213C)和A-7(F210V)，其中A-1的酶活力為100％，A-7的活力為21％，A-1的活力是A-7的4倍。第二輪，A-1

3、與A-7同時(shí)和C突變庫(kù)進(jìn)行組合突變，經(jīng)篩選得到另外一個(gè)有利突變酶A7C1(F210V/I367T)，活力為80％，是A-7的4倍。
　　 以CASTing最優(yōu)突變A-1為起點(diǎn)，通過易錯(cuò)PCR引入隨機(jī)突變，進(jìn)行隨機(jī)突變庫(kù)的篩選，得到一個(gè)突變酶ep-1（F210V/L213C/T162A），活力為189％，在A-1的基礎(chǔ)上提高1.9倍，底物譜研究表明，A-1與ep-1對(duì)所測(cè)的胺類底物均有催化能力，對(duì)其中4種芳香胺的催化能力比未突變的