多器官功能障礙綜合征大鼠小腸神經-cajal間質細胞-平滑肌網絡損傷和大承氣湯防治作用實驗研究.pdf

1、背景:多器官功能障礙綜合癥（multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS）是機體在嚴重創(chuàng)傷、感染、休克及大手術等原發(fā)病基礎上，同時或序貫發(fā)生的兩個或兩個以上器官或系統(tǒng)功能障礙的臨床綜合征。是腹部外科患者死亡的重要原因。近年來研究觀點認為，胃腸道是促發(fā)MODS的始動器官和靶部位。胃腸功能狀態(tài)被認為是判斷危重病人預后的一項重要指標。胃腸運動功能的恢復有助于有效地阻斷MODS的進一步發(fā)展。胃腸道Cajal間質細胞

2、(interstitialcellsofCajal,ICC)是胃腸慢波的起搏細胞，并且相互間形成網絡狀結構廣泛分布于消化道。ICC被認為是胃腸神經系統(tǒng)(entericnervesystem，ENS)信號向平滑肌細胞(smoothmusclecells，SMC)傳送的橋梁和中介。胃腸平滑肌細胞是胃腸電生理活動的最終執(zhí)行者。因此，目前研究觀點認為，ENS運動末梢、ICC和SMC三者相互連接成網絡樣結構，組成胃腸動力基本功能單位(basicf

3、unctionalunitofgastrointestinalmotility，BFUGM)，與胃腸運動功能障礙性疾病密切相關。
　　 目的:以細菌性腹膜炎致MODS大鼠模型為研究對象，觀察大鼠小腸ENS、ICC和平滑肌細胞SMC的形態(tài)學變化和凋亡現(xiàn)象，檢測細胞內外信號傳導通路和凋亡途徑相關蛋白的表達，以及大承氣湯防治后的變化。探討MODS致胃腸動力障礙的發(fā)生機制和大承氣湯的防治機理，為MODS致胃腸動力障礙的臨床預防和治療提供

4、新的思路。
　　 方法:選擇健康成年Wistar大鼠100只，雌雄各半，體重200g-250g，隨機分為對照組（20只）、MODS組（40只）和大承氣湯治療組（40只）。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水;MODS組和大承氣湯組大鼠采用無菌條件下腹腔注射E.coloi.懸濁液的方法建立細菌性腹膜炎致MODS模型。大承氣湯治療組于造模前2日予大承氣湯灌胃，2次/日，每次1ml/100g。造模24小時后取存活大鼠，麻醉后頸椎脫臼法處死，剖開

5、腹腔取上段小腸用于實驗。分別采用透射電鏡掃描、TUNEL法、免疫組化、免疫熒光和激光掃描共聚焦顯微鏡重建圖像等方法觀察大鼠小腸ENS、ICC和SMC的形態(tài)學變化和凋亡現(xiàn)象，檢測信號通路、凋亡途徑和凋亡相關蛋白的表達，及大承氣湯防治后的變化。
　　 結果:①小腸組織形態(tài)學和肌層細胞因子表達觀察:與對照組比較，MODS組大鼠小腸絨毛頂端破裂，粘膜層和肌層結構紊亂，大量炎性細胞浸潤，毛細血管擴張充血;小腸肌層CGRP、HSP70和TG

6、F-β1表達明顯升高(P＜0.05)。與MODS組比較，大承氣湯治療組大鼠小腸輕度損傷，絨毛結構完整，粘膜層和肌層充血明顯減輕，炎性細胞浸潤減少，SMC分布均勻;小腸肌層CGRP、HSP70和TGF-β1表達明顯減少（P＜0.05）。
　　 ②小腸腸神經系統(tǒng)觀察:與對照組比較，MODS組大鼠小腸神經元數(shù)量明顯減少，凋亡數(shù)量明顯增加，線粒體凋亡途徑Bax/Bcl-2和蛋白激酶凋亡途徑PKA/PKC蛋白表達明顯增加，信號傳導通路AC

7、h/SP/VIP/NO和細胞內信號載體蛋白caveolin-1表達明顯減少，NGF蛋白表達明顯減少（P＜0.05）。與MODS組比較，大承氣湯治療組大鼠小腸神經元數(shù)量明顯增加，凋亡數(shù)量明顯減少，線粒體凋亡途徑Bax/Bcl-2和蛋白激酶凋亡途徑PKA/PKC表達明顯減少，信號傳導通路ACh/SP/VIP/NO和細胞內信號載體蛋白caveolin-1表達明顯增加，NGF蛋白表達明顯增加(P＜0.05)。
　　 ③小腸ICC觀察:與

8、對照組比較，MODS組大鼠小腸ICC超微結構受到明顯破壞，細胞核染色質聚集在核中央和周邊，線粒體腫脹，縫隙連接減少;ICC凋亡數(shù)量、線粒體凋亡途徑Bax/Bcl-2和蛋白激酶凋亡途徑PKA/PKC表達明顯增加，細胞內信號載體蛋白caveolin-1表達明顯減少(P＜0.05)。與MODS組比較，大承氣湯治療組大鼠小腸ICC超微結構損傷輕微，少見細胞核染色質的聚集，個別線粒體腫脹，縫隙連接增加;ICC凋亡數(shù)量、線粒體凋亡途徑Bax/Bcl

9、-2和蛋白激酶凋亡途徑PKA/PKC表達明顯減少，細胞內信號載體蛋白caveolin-1表達明顯增加（P＜0.05）。
　　 ④小腸平滑肌觀察:與對照組比較，MODS組大鼠小腸平滑肌結構紊亂，細胞數(shù)量和肌動蛋白表達明顯減少，細胞凋亡數(shù)量和凋亡指數(shù)明顯增加，線粒體凋亡途徑Bax/Bcl-2/CytC/caspase-9/caspase-3、死亡受體凋亡途徑Fas/Fasl、蛋白激酶凋亡途徑PKA/PKC和凋亡相關蛋白COX-2/N

10、F-κB/P53表達明顯增加，信號傳導通路ACh/NO/SP/VIP、縫隙連接蛋白CX45和細胞內信號載體蛋白caveolin-1表達明顯減少，Ca2+通道蛋白IP3R和RyR表達明顯減少(P＜0.05)。與MODS組比較，大承氣湯治療組大鼠小腸平滑肌結構清晰，細胞數(shù)量和肌動蛋白表達明顯增加，細胞凋亡數(shù)量和凋亡指數(shù)明顯減少，線粒體凋亡途徑Bax/Bcl-2/CytC/caspase-9/caspase-3、死亡受體凋亡途徑Fas/Fas

11、l、蛋白激酶凋亡途徑PKA/PKC和凋亡相關蛋白COX-2/NF-κB/P53表達明顯減少，信號傳導通路ACh/NO/SP/VIP、縫隙連接蛋白CX45和細胞內信號載體蛋白caveolin-1表達明顯增加，Ca2+通道蛋白IP3R和RyR表達明顯增加(P＜0.05)。
　　 ⑤小腸腸神經系統(tǒng)-ICC-平滑肌細胞(ENS-ICC-SMC)網絡觀察:與對照組比較，MODS組大鼠小腸ENS-ICC-SMC網絡的超微結構明顯破壞，ICC

12、與腸神經的連接減少，與SMC間的縫隙連接減少，間距增大，腸神經、ICC和SMC的數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。與MODS組比較，大承氣湯治療組大鼠小腸ENS-ICC-SMC網絡的超微結構明顯修復，ICC與腸神經的連接緊密，與SMC間的縫隙連接增加，間距減少，腸神經、ICC和SMC數(shù)量明顯增加(P＜0.05)。
　　 結論:①MODS大鼠胃腸道明顯擴張，致死率極高，小腸肌層中CGRP、TGF-β1蛋白表達的增加可能導致小腸肌層組織

13、炎癥反應和應激損傷的加劇，同時上調HSP70蛋白的表達發(fā)揮自我保護作用。而大承氣湯可以明顯地降低MODS大鼠的死亡率，促進胃腸動力的恢復。大承氣湯可以通過下調大鼠小腸肌層組織中的CGRP、TGF-β1蛋白的表達，抑制炎癥反應和應激損傷的加劇，從而下調HSP70蛋白的表達，保護小腸平滑肌的收縮功能。
　　 ②MODS大鼠小腸神經可能通過線粒體和蛋白激酶凋亡途徑的激活、細胞內外信號傳導通路的損傷以及NGF表達的下降使得小腸神經凋亡數(shù)

14、量明顯增加，形態(tài)結構受到明顯破壞。而大承氣湯可以明顯地抑制線粒體和蛋白激酶凋亡途徑的激活、保護細胞內外信號傳導通路和NGF的表達，從而明顯減輕小腸神經的凋亡和損傷，修復小腸神經的形態(tài)結構，促進胃腸動力的恢復。
　　 ③MODS大鼠小腸ICC凋亡數(shù)量增加，網絡樣結構受到明顯破壞，其機制可能與超微結構的損傷、線粒體和蛋白激酶凋亡途徑的激活和細胞內信號載體蛋白caveolin-1表達的減少有關。而大承氣湯可以通過明顯地保護ICC的超微

15、結構、抑制線粒體和蛋白激酶途徑的激活和保護信號載體蛋白caveolin-1的表達，從而抑制ICC的凋亡，修復ICC網絡樣結構，恢復胃腸動力。
　　 ④MODS大鼠小腸SMC凋亡數(shù)量明顯增加，形態(tài)結構損傷嚴重，其機制可能是平滑肌肌動蛋白和Ca2+通道蛋白IP3R和RyR表達的減少，線粒體、死亡受體、蛋白激酶凋亡途徑的激活，凋亡相關蛋白COX-2/NF-κB/P53表達的增加，以及細胞內外信號傳導通路的損傷。而大承氣湯可以通過明顯地

16、保護平滑肌肌動蛋白和Ca2+通道蛋白IP3R和RyR的表達，抑制線粒體、死亡受體、蛋白激酶凋亡途徑的激活，下調凋亡相關蛋白COX-2/NF-κB/P53的表達，保護細胞內外信號傳導通路等機制，減少小腸SMC的凋亡數(shù)量，保護平滑肌的形態(tài)結構，促進胃腸動力的恢復。
　　 ⑤MODS大鼠小腸ENS-ICC-SMC網絡結構受到明顯破壞，其機制可能與超微結構的損傷，小腸神經、ICC和SMC數(shù)量的明顯減少密切相關。而大承氣湯可以明顯地保護E