微溝槽圖形結(jié)構(gòu)硅橡膠研發(fā)及生物相容性初步研究.pdf

1、目的：
　　在課題組前期研究中，采用羥基磷灰石進(jìn)行表面仿生涂層、β-磷酸三鈣和硅橡膠進(jìn)行共混交聯(lián)復(fù)合，以及以人體碳元素(C)注入等方式改變硅橡膠表面某些性能，以此改善人成纖維細(xì)胞在此表面的粘附、增殖能力等。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，幾種改性材料的表面形貌均較普通硅橡膠發(fā)生了變化，提示我們硅橡膠的表面形貌影響材料的細(xì)胞相容性。為進(jìn)一步研究材料表面的微形貌對其理化性能以及細(xì)胞相容性的影響，本實(shí)驗(yàn)通過在表面設(shè)計(jì)微溝槽圖形結(jié)構(gòu)，以此探究表面性能以及細(xì)胞

2、增殖、粘附等細(xì)胞行為，同時(shí)建立大鼠背部軟組織缺損動物模型，對改性前后的硅橡膠進(jìn)行植入應(yīng)用觀察，以期能研制出具有良好軟組織填充材料提供理論依據(jù)。
　　利用具有微溝槽圖形的方形母版，采用澆灌的方法成功制作表面具有微溝槽圖形的硅橡膠改性材料，同時(shí)統(tǒng)一劑量的碳離子注入改性，并選用掃描電鏡（ScanningElectron Microscope，SEM）、原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)技術(shù)觀察改性前后

3、材料表面的微觀形貌的變化，X射線光電子能譜（X-ray photoelectronspectroscopy，XPS），水接觸角等技術(shù)衡量改性前后材料的表面物理化學(xué)性能。同時(shí)采用了一系列體外實(shí)驗(yàn)研究改性前后的材料細(xì)胞相容性，以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析以及評價(jià)改性前后材料的組織相容性，以期能制備出一種符合臨床需要，且副作用相對較小的新型軟組織填充材料。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)分四部分
　　第一部分:制備母版和SR、P-SR的制備以及

4、碳離子注入處理表面
　　1.兩種硅橡膠的制備
　　a.具有微溝槽圖形結(jié)構(gòu)的硅橡膠制備
　　具有微溝槽圖形的12cm×12cm方形玻璃母版（中國電子科技集團(tuán)公司第二十六研究所提供），鐵質(zhì)外框由重慶銀利來模具有限公司制作。將室溫硫化雙組份醫(yī)用液態(tài)硅硅橡膠（成都晨光化工研究院）A、B組分按1∶1混勻后澆灌到母板上，室溫下硫化3-4h成膜，取下具有微圖形結(jié)構(gòu)的硅橡膠(P-SR)待下一步實(shí)驗(yàn)。
　　b.光滑的硅橡膠制備

5、r>　　將同種硅橡膠原材料相同比例混勻后，澆灌到超聲鏡面的模板上(自制)，待其室溫完全硫化后選擇平整光滑、無殘缺的硅膠片作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.將SR、P-SR放入多功能離子注入機(jī)里進(jìn)行碳離子注入，劑量為1×1016 ions/cm2，形成C-SR、PC-SR。本步驟由西南核工業(yè)物理研究所完成。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組:為普通硅橡膠SR，具有微溝槽圖形的硅橡膠P-SR，碳硅橡膠C-SR，碳離子注入后的微溝槽圖形硅橡膠PC-SR。

6、r>　　第二部分:各組硅橡膠微形貌的觀察以及理化性能的檢測
　　樣本表面的微觀結(jié)構(gòu)布局能夠通過SEM、AFM技術(shù)手段觀測。評價(jià)改性前后硅橡膠表面的理化性能則是通過XPS、水接觸角分析。
　　第三部分:材料的細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)
　　1.細(xì)胞的準(zhǔn)備:體外培養(yǎng)法培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞，將其接種于各組實(shí)驗(yàn)樣本表面，以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組情況:SR組、P-SR組、P-SR組、PC-SR組。在各組材料表面上接種人真皮成纖

7、維細(xì)胞。
　　3.各組材料表面細(xì)胞的細(xì)胞骨架(actin)熒光表達(dá)情況由激光共聚焦顯微鏡可觀測材料上細(xì)胞的骨架熒光表達(dá)情形，間接了解材料表面的細(xì)胞形態(tài)以及排列情況;并采用CCK-8法檢測細(xì)胞在各組改性硅橡膠表面1天、2天、4天、6天的增殖情況，采用SSPS17.0進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)。
　　4.應(yīng)用Western Blot檢測分析各組材料上人真皮成纖維細(xì)胞粘附相關(guān)蛋白Talin、Zyxin、Vinculin的表達(dá)情況，并對其

8、進(jìn)行生物學(xué)評價(jià)。
　　第四部分:材料的組織相容性實(shí)驗(yàn)
　　1.建立大鼠背部軟組織缺損動物模型
　　a.購置160-200g雌性成年SD大鼠3只;
　　b.將各組改性前后的硅橡膠裁剪成1cm×1cm大小，消毒備用;
　　c.3％戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠，麻醉顯效后，常規(guī)去毛、消毒鋪巾，背部近背脊兩側(cè)做6cm×6cm大小術(shù)區(qū)，做0.5cm縱形切口至皮下，鈍性分離出約1.5cm×1.5cm的潛行腔隙，將備用的硅橡膠

9、放置腔隙，切口間斷縫合、消毒;
　　d.埋置時(shí)間7天、15天、1月;
　　2.根據(jù)埋置時(shí)間，適時(shí)取材，觀察大體形態(tài)以及放置液氮灌里存放;
　　3.采用HE、Masson、免疫組化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察組織-材料反應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　1.成功制備出具有微溝槽圖形的P-SR，以及光滑的SR，并采用多功能離子注入機(jī)在統(tǒng)一條件下進(jìn)行碳離子注入，制備出具有微溝槽圖形的碳硅橡膠PC-SR，以及碳硅橡膠C-SR。
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10、.使用SEM觀察改性前后硅橡膠的表面形貌，未發(fā)現(xiàn)微觀形貌有明顯差異。而進(jìn)一步采用AFM觀察，可見普通SR表面光滑;P-SR上可見溝槽整齊的微溝槽圖形;進(jìn)行碳離子注入后的C-SR呈凸凹不平的丘陵地貌，“突出”與“凹陷”形貌各異，并無統(tǒng)一性;而PC-SR見在整齊的微溝槽圖形間可見凹凸形貌。
　　3.XPS分析顯示:注入C后，C-SR、PC-SR與SR、P-SR比較，C、Si、O三種元素的峰值發(fā)生改變。水接觸角分析得到:微溝槽增加了硅橡

11、膠表面的疏水性;而碳離子注入則增加其表面的親水性。
　　4.通過激光共聚焦顯微鏡觀察各組材料表面人真皮成纖維細(xì)胞的骨架情況，間接查看出材料表面形貌學(xué)對細(xì)胞形態(tài)的影響。人真皮成纖維細(xì)胞在SR的生長情況較差，細(xì)胞稀疏，排列無序;P-SR組細(xì)胞生長情況較SR類似，但細(xì)胞梭形較SR明顯，排列有序。C-SR組細(xì)胞生長情況優(yōu)于SR，且細(xì)胞形態(tài)鋪展，面積增大;PC-SR組，細(xì)胞生長優(yōu)于SR和P-SR,略差于C-SR，細(xì)胞鋪展情況優(yōu)于SR和P-S

12、R，但較C-SR差，細(xì)胞的排列較C-SR組相比有序。掃描電鏡觀察各組材料表面人真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，觀察到材料表面形貌可影響細(xì)胞形態(tài)以及排列情況。人真皮成纖維細(xì)胞在SR排列無序;P-SR組細(xì)胞生長情況較SR類似，排列有序。C-SR組細(xì)胞鋪展面積增大;PC-SR組細(xì)胞的排列較C-SR組相比有序。
　　5.各種硅橡膠表面對細(xì)胞增殖的影響由CCK-8法測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:C-SR組和PC-SR組分別與SR組和P-SR組相比，細(xì)胞增殖

13、明顯提高（*P＜0.05），其中C-SR組細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，PC-SR稍次之，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各組硅橡膠表面對細(xì)胞粘附的影響和細(xì)胞的增殖趨勢基本一致。
　　6.Western blot檢測各種材料表面細(xì)胞粘附相關(guān)蛋白(Talin、Zyxin、Vinculin)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)改性后的硅橡膠蛋白表達(dá)高于普通硅橡膠，但C-SR與PC-SR之間的蛋白表達(dá)情況與細(xì)胞增殖情況一致。
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14、.成功建立大鼠背部軟組織缺損動物模型。
　　8.HE染色可見急性期（7天），各組材料炎性細(xì)胞浸潤明顯，各組細(xì)胞數(shù)量差距不明顯;亞急性期（15天）以及慢性期（30天）各組材料周圍趨化的炎性細(xì)胞數(shù)量漸少，且經(jīng)過碳離子注入后的硅橡膠(C-SR、PC-SR)周圍的炎性反應(yīng)明顯低于未注入組(SR、P-SR);表面經(jīng)過微圖案化處理后的硅橡膠周圍的炎性細(xì)胞數(shù)量也較對照組少(P-SR＜SR; PC-SR＜C-SR)，說明微溝槽圖形化的碳硅橡膠相比

15、普通硅橡膠，對機(jī)體炎性刺激較小。
　　9.Masson染色以及α-SMA以及Vimentin免疫組化均可表達(dá)材料周圍包膜主要成分膠原成分，其結(jié)果顯示植入后前期，材料周圍的纖維化不甚明顯，而后期包膜厚度增加，而同一時(shí)期比較，經(jīng)過碳離子處理的硅橡膠(C-SR、PC-SR)周圍的包膜厚度以及膠原沉積程度明顯低于未注入組(SR、P-SR);表面經(jīng)過微圖案化處理后的硅橡膠周圍的膠原沉積程度也較對照組少(P-SR＜SR; PC-SR＜C-SR

16、)，以此可推測經(jīng)過微溝槽圖形化與碳離子注入的硅橡膠包膜厚度較薄，膠原沉積較少，材料與機(jī)體組織具有更好的契合度。
　　結(jié)論：
　　1.微溝槽結(jié)構(gòu)的碳硅橡膠制作方法簡便，易于操作。
　　2.微溝槽結(jié)構(gòu)碳硅橡膠表面理化性能穩(wěn)定，適度增加表面疏水性。
　　3.PC-SR可增加粘附以及增殖能力，且表面微結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞有序排列，提示材料表面微圖形對細(xì)胞功能具有顯著影響，為設(shè)計(jì)出具有臨床需求的植入材料提供理論依據(jù)。
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