基于新型碳納米材料的ATP快速檢測(cè)方法研究.pdf

1、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)是一類普遍存在的能源物質(zhì)，它廣泛存在于各種生物體內(nèi)，并發(fā)揮了極其重要的作用。ATP在生物體內(nèi)的主要功能包括:存儲(chǔ)能量、傳遞能量、參與各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成、促進(jìn)各種細(xì)胞的修復(fù)以及再生、維持生物體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。通過(guò)對(duì)ATP的含量進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)藥物或生物制劑對(duì)細(xì)胞的殺傷作用進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，并且可以對(duì)一些疾病進(jìn)行早期的診斷及治療。在本研究中，基于新型碳納米材料，設(shè)計(jì)了兩種新型核酸適配

2、體傳感器分別對(duì)ATP進(jìn)行快速檢測(cè)。該研究主要包括以下兩方面內(nèi)容:
　　1、基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移以及核酸外切酶Ⅰ與核酸外切酶Ⅲ的酶解活性，構(gòu)建了一個(gè)檢測(cè)ATP的新型核酸適配體生物傳感器。當(dāng)反應(yīng)體系中不存在靶標(biāo)ATP時(shí)，探針1被核酸外切酶Ⅰ逐個(gè)水解成寡核苷酸。當(dāng)向反應(yīng)體系中加入靶標(biāo)ATP后，探針1上的ATP適配體序列與ATP相互結(jié)合，由于空間位阻的作用，結(jié)合上ATP的探針1能夠避免被核酸外切酶Ⅰ水解成寡核苷酸。隨后，結(jié)合上ATP的探針

3、1能夠與事先吸附于氧化石墨烯上的探針2雜交配對(duì)，配對(duì)所形成的雙鏈DNA，被核酸外切酶Ⅲ識(shí)別、酶解。熒光基團(tuán)FAM與氧化石墨烯之間距離的拉大，阻斷了熒光能量共振轉(zhuǎn)移，F(xiàn)AM的熒光得以恢復(fù)。通過(guò)向體系中加入核酸外切酶Ⅲ，該生物傳感器的熒光信號(hào)大大增強(qiáng)了且與ATP的濃度（從0到3μM）存在良好的線性關(guān)系。通過(guò)對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌中ATP進(jìn)行有效檢測(cè)，我們可以得出:該生物傳感器能夠被應(yīng)用到實(shí)際樣品的檢測(cè)中。
　　2、基于重金屬離子(Hg2

4、+）對(duì)碳納米顆粒的淬滅效應(yīng)，構(gòu)建了一個(gè)新型核酸適配體生物傳感器對(duì)ATP進(jìn)行快速檢測(cè)。體系中汞離子的存在，使得探針1與不完全互補(bǔ)的探針2形成含有T-Hg2+-T復(fù)合物(T-T mismatch)的雙鏈結(jié)構(gòu)。當(dāng)反應(yīng)溶液中不存在靶標(biāo)ATP時(shí)，含有T-Hg2+-T復(fù)合物(T-T mismatch)的雙鏈結(jié)構(gòu)能夠穩(wěn)定地存在于檢測(cè)溶液中，而碳納米顆粒由于沒(méi)有受到重金屬離子(Hg2+)的淬滅作用，能夠被檢測(cè)到強(qiáng)的熒光。然而，當(dāng)向體系中加入靶標(biāo)ATP后

5、，ATP能夠迅速地與雙鏈結(jié)構(gòu)中的適配體相結(jié)合，此時(shí)雙鏈被解開(kāi)，先前穩(wěn)定的T-Hg2+-T的復(fù)合物(T-T mismatch)結(jié)構(gòu)遭到破壞，重金屬離子（Hg2+）被釋放出來(lái)，與體系中游離的碳納米顆粒形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。由于重金屬離子對(duì)碳納米顆粒的淬滅作用，碳納米顆粒的熒光強(qiáng)度減弱。隨著ATP濃度的增加，越來(lái)越多的Hg2+被釋放出來(lái)，體系中碳納米顆粒的熒光強(qiáng)度也將繼續(xù)降低，最終達(dá)到穩(wěn)定。該檢測(cè)方法不僅可以用于檢測(cè)ATP，也為其他生物分子的快速