用于發(fā)酵黃芪的益生菌株FGM誘變德育及突變株特性研究.pdf

1、黃芪多糖具有多種重要的藥理作用，非解乳糖鏈球菌FGM是分離自雞盲腸，能夠發(fā)酵黃芪，提高多糖提取率的益生菌。為了進(jìn)一步提升菌株FGM的發(fā)酵性能，揭示黃芪經(jīng)發(fā)酵后多糖含量提高的潛在機(jī)制，本研究采用紫外線(UV)和亞硝基胍(NTG)對(duì)FGM進(jìn)行誘變選育，用誘變菌株發(fā)酵黃芪，通過水提醇沉法提取發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖，苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量，篩選得到了兩株高多糖得率菌株，分別從穩(wěn)定性、安全性、生化特征、發(fā)酵酶的相關(guān)基因克隆和表達(dá)等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)和研究，并

2、對(duì)菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序與比較基因組學(xué)分析。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)采用UV、NTG和UV-NTG復(fù)合誘變的方法，對(duì)FGM株進(jìn)行誘變選育。結(jié)果顯示，UV照射10～120 s所得的菌株發(fā)酵黃芪后產(chǎn)物中多糖含量均呈升高趨勢(shì)，NTG處理所得菌株發(fā)酵黃芪后產(chǎn)物中多糖含量變化無規(guī)律性。UV誘變的最佳條件是在紫外燈下處理90 s，最終發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量為235.51 mg/g，較出發(fā)菌株提高了58.13％，將該菌株命名為U90; UV-N

3、TG復(fù)合誘變的最佳條件是先用紫外燈照射10s，再用1.0 g/L的NTG處理10 min，最終其發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量可達(dá)293.39 mg/g，較出發(fā)菌株提高了94.99％，將該菌株命名為UN10-1。
　　(2)將U90和UN10-1連續(xù)傳代10次，每代均分析發(fā)酵黃芪后多糖的提取率，評(píng)價(jià)遺傳穩(wěn)定性。U90連續(xù)傳6代，取每代菌株發(fā)酵黃芪后產(chǎn)物中多糖含量穩(wěn)定在233.6±1.66 mg/g，第4代多糖含量最高，為235.85±0.78

4、 mg/g，從7代開始多糖含量隨傳代次數(shù)增加而減少。菌株UN10-1產(chǎn)糖量比較穩(wěn)定，含量為292.06±0.89 mg/g。生化鑒定結(jié)果提示，UN10-1連續(xù)傳代10次產(chǎn)糖量仍趨于穩(wěn)定的原因可能與其能利用核糖、乳糖、阿拉伯糖有關(guān)。
　　(3)分別用UN10-1菌懸液和48 h黃芪發(fā)酵液灌胃小鼠，0.5 mL/次，1次/d，連續(xù)灌胃3d，觀察7d，灌服等量生理鹽水作對(duì)照。觀察記錄小鼠日常行為及體重，測(cè)定血液生理指標(biāo)，觀察主要臟器（心

5、、肝、脾、肺、腎、胸腺、小腸）及組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，UN10-1對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育及組織形態(tài)學(xué)無不良影響，提示該菌株安全無毒。
　　(4)分析了UN10-1發(fā)酵產(chǎn)糖相關(guān)基因galE、dexB、aga2、ldh、recA。成功擴(kuò)增出recA和aga2基因，以recA為內(nèi)參基因分析了aga2基因在黃芪發(fā)酵過程中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，aga2基因在發(fā)酵24 h內(nèi)表達(dá)呈上升趨勢(shì)，24 h時(shí)該基因表達(dá)量是初始發(fā)酵的9.54倍;24 h～60

6、h該基因表達(dá)呈下降趨勢(shì)，60 h～72 h又略有升高。
　　(5)比較基因組學(xué)分析結(jié)果顯示，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋得到FGM和UN10-1位于糖代謝通路上的基因分別有125個(gè)和124個(gè)，SNP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)UN10-1有1個(gè)無義突變位點(diǎn)和26個(gè)位于基因區(qū)的非同義突變位點(diǎn)。
　　綜上所述，采用UV和NTG復(fù)合誘變益生菌FGM可獲得發(fā)酵黃芪提取多糖性能更優(yōu)的菌株UN10-1，該菌株對(duì)小鼠無毒副作用;誘變菌株UN10-1與出發(fā)菌株FGM