雞蛋膽固醇營養(yǎng)效果及其脂質(zhì)調(diào)控成分篩選與機(jī)理研究.pdf

1、針對(duì)雞蛋膽固醇其營養(yǎng)作用目前仍有爭議的現(xiàn)狀，本文以雞蛋及其活性成分作為研究對(duì)象，開展了雞蛋膽固醇營養(yǎng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、雞蛋調(diào)控膽固醇活性成分的篩選及雞蛋活性脂質(zhì)調(diào)控膽固醇吸收代謝的機(jī)理研究等系列工作。主要的研究內(nèi)容和主要研究成果摘要如下:
　　 本實(shí)驗(yàn)以健康Sprague Dawley大鼠為動(dòng)物模型，攝入同等膽固醇含量的化學(xué)膽固醇(CLG)、蛋黃(EYG)、全蛋(WEG)及不含膽固醇的普通飼料(CCG)進(jìn)行飲食干預(yù)90 d，系統(tǒng)檢測膽固

2、醇及其代謝物在大鼠體內(nèi)各臟器、血液及糞便中的含量，通過肝臟切片觀察病變，運(yùn)用RT-qPCR檢測膽固醇相關(guān)代謝酶的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)EYG組與WEG組大鼠的身體狀況、血脂、肝脂等與CCG組相比無顯著差異，但與CLG組相比較，其肝臟TG、TC及LDL-膽固醇，肝臟TG與TC，肝臟損傷程度，肝臟羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoAR)與?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)的mRNA表達(dá)量都顯著性地降低;而肝臟HDL-膽固醇

3、與TBA，糞便中性固醇與TBA，肝臟低密度脂蛋白受體(LDLr)、膽固醇-7α羥化酶(CYP7A1)與卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的mRNA表達(dá)量均顯著性地升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雞蛋對(duì)健康SD大鼠血脂無顯著性影響，雞蛋的攝入能顯著抑制膽固醇體內(nèi)從頭合成及以膽固醇酯的形式在體內(nèi)儲(chǔ)存，促進(jìn)了膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化，并隨糞便排出。
　　 建立了體外Caco-2細(xì)胞單層吸收模型，并從形態(tài)學(xué)、酶學(xué)、跨膜電阻及通透率對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4、發(fā)現(xiàn)經(jīng)過21 d培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞可以作為小腸吸收的體外模型，倒置顯微鏡與電鏡檢查，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞單層模型的A側(cè)分化形成微絨毛與細(xì)胞間形成了完整的緊密連接結(jié)構(gòu)，細(xì)胞單層模型的跨膜電阻值均符合220Ω·cm2-600Ω.cm2的要求，細(xì)胞單層的標(biāo)志性酶（堿性磷酸酶）活力增加表現(xiàn)出明顯的極化，熒光黃A-B側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)的滲透系數(shù)低于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)規(guī)定的1.0×10-6 cm/s。上述結(jié)果表明建立的Caco-2細(xì)胞單層模型符合物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的條件，可以作為膽固

5、醇吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究的體外模型。以Caco-2細(xì)胞單層為模型，研究了一系列濃度的膽固醇在不同pH值下的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)情況，以及NPC1L1蛋白抑制劑依折麥布(Eetimibe)對(duì)膽固醇細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膽固醇在Caco-2細(xì)胞單層模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)表現(xiàn)為一定的濃度與pH值依賴性和飽和性，在膽固醇添加濃度為100μmol/L供液pH值為7.4條件下，膽固醇在Caco-2細(xì)胞單層模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)滲透系數(shù)最高，其攝入比為4.73，膽固醇在Caco-2細(xì)

6、胞單層吸收過程中受到載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)，而膽固醇外排是以被動(dòng)擴(kuò)散的方式轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)加入Ezetimibe(10μmol/L)之后膽固醇攝入比顯著降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明膽固醇在Caco-2細(xì)胞單層模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)為載體蛋白NPC1L1介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 以Caco-2細(xì)胞單層為模型，提取雞蛋中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)類組分，借助體外人工胃腸模擬消化系統(tǒng)，采用液體閃爍追蹤3-H-膽固醇，研究各組分對(duì)膽固醇在Caco-2細(xì)胞單層模型中攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。實(shí)

7、驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞蛋中的蛋白質(zhì)（蛋清總蛋白質(zhì)、蛋黃總蛋白質(zhì)及卵黏蛋白）、磷脂（卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂）及n-3系列的多不飽和脂肪酸（EPA與DHA）能顯著地抑制Caco-2細(xì)胞中膽固醇的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)，棕櫚酸與溶血卵磷脂能夠促進(jìn)Caco-2細(xì)胞中膽固醇的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)，而單不飽和脂肪酸與腦磷脂對(duì)Caco-2細(xì)胞中膽固醇的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)無顯著性影響。上述結(jié)果表明雞蛋中含有調(diào)控膽固醇吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的成分，為進(jìn)一步揭示其對(duì)膽固醇代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控及機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

8、>　　 考察雞蛋各磷脂成分對(duì)膽固醇微膠束化學(xué)組成、?；悄懰徕c結(jié)合能力、微膠束中膽固醇與?；悄懰猁}的溶解能力及微膠束分子量變化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋黃卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂的添加促進(jìn)了膽固醇參與微膠束的形成，且隨著添加量的增加使得牛磺膽酸鈉的結(jié)合能力增強(qiáng)。當(dāng)微膠束孵育24 h后，蛋黃卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂組的鹽溶液中膽固醇溶解度顯著地低于其他組，蛋黃神經(jīng)鞘磷脂組的牛磺膽酸鈉的溶解度顯著性降低。此外，微膠束的分子量隨著蛋黃卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂添加

9、濃度的增加而增加，表明微膠束釋放的速度受到了這兩種磷脂的約束，減慢了微膠束中膽固醇通過靜止水層向腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)前的釋放過程。以上結(jié)果表明雞蛋卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂通過改變膽固醇混合微膠束的物理化學(xué)性質(zhì)，在一定程度上抑制了微膠束向小腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。
　　 通過RT-qPCR與Westem-blot檢測不同濃度雞蛋卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂對(duì)Caco-2細(xì)胞膽固醇吸收通路中關(guān)鍵蛋白轉(zhuǎn)錄與翻譯水平表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞蛋卵磷脂與神經(jīng)鞘磷

10、脂均能顯著性抑制小腸膽固醇吸收關(guān)鍵蛋白NPC1L1（尼曼-匹克C1型類似蛋白1）的轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而抑制膽固醇在Caco-2細(xì)胞中的攝入與轉(zhuǎn)運(yùn)。雞蛋卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂對(duì)于NPC11L基因與蛋白表達(dá)的抑制可能與轉(zhuǎn)錄因子SREBP（固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白）激活受到抑制相關(guān)。雞蛋卵磷脂通過促進(jìn)膽固醇合成HDL的方式移除Caco-2細(xì)胞中多余的膽固醇。此外，高濃度的蛋黃神經(jīng)鞘磷脂有可能通過下調(diào)Caveolin1基因表達(dá)從而抑制膽固醇的吸收。

11、　　 通過RT-qPCR與Western-blot檢測雞蛋中六種脂肪酸(PA、OA、LA、AA、EPA、DHA)對(duì)Caco-2細(xì)胞膽固醇吸收通路中關(guān)鍵蛋白轉(zhuǎn)錄與翻譯水平表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPA與DHA均能顯著性抑制小腸膽固醇吸收關(guān)鍵蛋白NPC1L1的轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而抑制膽固醇在Caco-2細(xì)胞中的攝入與轉(zhuǎn)運(yùn)，而高濃度的PA與OA通過促進(jìn)NPC1L1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)使得膽固醇在Caco-2細(xì)胞中的攝入與轉(zhuǎn)運(yùn)增加，且NPCL1L基因的