培養(yǎng)條件對保加利亞乳桿菌蛋白水解體系關鍵酶基因表達影響的研究.pdf

1、乳酸菌作為發(fā)酵劑已經(jīng)廣泛應用于乳制品生產(chǎn)加工過程中。由于乳酸菌自身不能直接利用外源蛋白質(zhì)，必須通過蛋白水解體系將外源蛋白水解為游離氨基酸，供菌體正常生長需要。乳酸菌的蛋白水解體系包括胞外酶、轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和胞內(nèi)肽酶三個部分。首先，胞外酶將外源蛋白質(zhì)水解為多肽;多肽由轉(zhuǎn)運系統(tǒng)運送至胞內(nèi);再由胞內(nèi)肽酶將其水解為游離氨基酸。因此，蛋白水解體系中各種蛋白酶的活性及其基因的表達情況直接影響乳酸菌發(fā)酵劑的品質(zhì)。蛋白水解體系中各種蛋白酶基因的表達不僅在不同

2、菌株之間和不同生長階段存在差異，還受到氮源的種類和含量、培養(yǎng)基初始pH和培養(yǎng)溫度的影響。
　　 本實驗選取蛋白水解能力較高的保加利亞乳桿菌，對其蛋白水解體系中部分關鍵酶基因的表達情況進行研究。菌體經(jīng)活化后分別在正常液體MRS培養(yǎng)基、N缺乏MRS培養(yǎng)基和添加酪蛋白胨的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后備用，正常液體MRS培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)至5.6、5.9、6.2和6.5，培養(yǎng)溫度分別設置為30℃、37℃、42℃和45℃。利用實時熒光

3、定量PCR技術(shù)測定目的基因(OppD、PrtB、PepC、PepF、PepQ、PepX、PepT)在不同菌株之間、不同生長時期、不同氮源、不同初始pH和不同溫度培養(yǎng)下的表達量，分析保加利亞乳桿菌蛋白水解體系中關鍵酶基因表達的變化規(guī)律。
　　 試驗結(jié)果表明，保加利亞乳桿菌蛋白水解體系中關鍵酶基因的表達在不同菌株之間存在顯著差異(p＜0.05)，但是未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。
　　 隨著菌體的不斷生長，關鍵酶基因的表達水平呈現(xiàn)顯著

4、的下調(diào)趨勢(p＜0.05)。各目的基因在對數(shù)初期(6h)的表達量是實驗中選取四個時間點中的最大值;隨著菌體的不斷生長，到對數(shù)中期(12h)和對數(shù)末期(18h)時，表達量與對照組(6h)相比，顯著下調(diào);在培養(yǎng)時間18h時，各目的基因的下降幅度與對照組相比均較大，平均下降了15.6倍，差異極顯著(p＜0.01)。到穩(wěn)定期(24h)時各基因的表達量降到最低，與對數(shù)初期的表達量相比平均下降了34倍，差異極顯著(p＜0.01)。
　　 在

5、N缺乏培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)12h,OppD、PrtB和PepF的表達量與正常狀態(tài)培養(yǎng)下（對照組）相比顯著上調(diào)，平均分別上調(diào)1.7倍、2.4倍和3.2倍。而其他基因的表達水平在不同菌株之間呈現(xiàn)顯著差異。在添加酪蛋白胨的培養(yǎng)條件下，各目的基因的表達水平與對照組相比均顯著下調(diào)。
　　 培養(yǎng)基的初始pH對目的基因表達也存在顯著影響。在部分菌株(08006、08007、08012、08016)中，各基因的表達水平隨著pH值的升高而升高。其中，

6、各目的基因在初始pH6.5時的表達量與對照組(pH5.6)相比上調(diào)了3.9-10.0倍。而在其他菌株(08014、08015、08017)中各目的基因的表達量與對照組(pH5.6)相比顯著下降，在pH5.9時平均下調(diào)了2.1倍:但是，在pH5.9、pH6.2和pH6.5之間的變化較平穩(wěn)。由此看來，基因的表達水平受到諸多因素的影響，并且在菌株之間存在顯著差異.
　　 培養(yǎng)溫度過高(45℃)，導致菌體生長過快，較先進入穩(wěn)定期，因此基

7、因的表達量與低溫度培養(yǎng)時顯著下調(diào)，與對照組(30℃)相比下調(diào)幅度為2.0-10.7倍，這與不同生長階段基因的表達結(jié)果相符。培養(yǎng)溫度過低，對于部分菌體來說，抑制其生長，同樣導致基因的水平降低。
　　 綜上所述，保加利亞乳桿菌蛋白水解體系中關鍵酶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達情況在同一菌種不同菌株之間存在顯著差異，并且基因的表達量從菌體生長的對數(shù)初期到穩(wěn)定期呈現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢。此外，菌體培養(yǎng)環(huán)境中氮源含量及種類、初始pH和培養(yǎng)溫度對基因表達