水解進(jìn)程對(duì)乳蛋白酶解產(chǎn)物抗菌性能的影響研究.pdf

1、生物活性肽是指對(duì)生命活動(dòng)具有調(diào)節(jié)作用的多肽，通常以多肽鏈序列的形式存在于蛋白質(zhì)之中。利用天然的蛋白質(zhì)作為原料，使用蛋白酶水解制取各種生物活性肽，是生物活性肽制備技術(shù)中最具可行性的一種。使用酶解法制取生物活性肽，有間歇式水解和酶膜生物反應(yīng)器中連續(xù)水解兩種手段，前者自動(dòng)化程度低，操作簡便，后者可以連續(xù)運(yùn)行，生產(chǎn)效率高。
　　 抗菌肽是生物活性肽家族中的一員，它是生物體抵抗外來微生物侵襲的重要手段，通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑

2、制細(xì)胞呼吸和DNA合成等機(jī)制來達(dá)到抑菌作用。從制備抗菌肽的天然蛋白質(zhì)的來源上講，乳蛋白是制備抗菌肽的重要原料。乳蛋白中的乳酪蛋白、乳清蛋白和乳鐵蛋白，它們的水解產(chǎn)物對(duì)微生物的影響存在差異。本論文的研究，主要分為以下幾個(gè)部分：第一是探索了乳蛋白的分離與檢測(cè)技術(shù)，優(yōu)化分離工藝，提出了新的乳鐵蛋白的檢測(cè)方法；第二是在間歇式反應(yīng)條件下，對(duì)不同類型的乳蛋白進(jìn)行酶解，優(yōu)化酶解反應(yīng)條件，測(cè)定水解產(chǎn)物的抗菌特性；第三是嘗試在酶膜反應(yīng)器中連續(xù)水解乳蛋白制

3、備抗菌肽。
　　 論文首先以脫脂乳粉作為原料，通過控制等電點(diǎn)的手段制備酪蛋白，得率可以達(dá)到7.8％。除去酪蛋白后的乳清，在中性條件下經(jīng)過10K的超濾膜處理，可以脫去其中的乳糖和鹽分，成為高純度的乳清分離蛋白。
　　 論文提出了一種借助高效液相色譜測(cè)定乳制品中乳鐵蛋白的方法。先通過額外加入的亞鐵離子使乳鐵蛋白的構(gòu)型更加穩(wěn)定。然后用60％乙醇沉淀蛋白除去糖分，再用醋酸鹽緩沖液提取乳鐵蛋白并分離掉酪蛋白，最后用高效液相色譜檢測(cè)

4、。采用LiChrosorb RP-C18色譜柱，在0.1％三氟乙酸協(xié)助下，甲醇與水線性梯度洗脫。乳鐵蛋白的線性范圍是0.4～2mg/mL(R2=0.9980)，平均回收率95.4％?？梢杂糜谝话闳橹破分腥殍F蛋白的測(cè)定。
　　 此外，一種借助乳鐵蛋白鐵結(jié)合能力測(cè)定奶粉中乳鐵蛋白的方法也被提出并與HPLC的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。先通過額外加入的亞鐵離子使乳鐵蛋白中的鐵達(dá)到飽和以獲得穩(wěn)定的鐵含量，然后對(duì)蛋白反復(fù)醇沉和水溶以除去游離鐵，再用

5、原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鐵含量，依據(jù)鐵與蛋白含量的相互關(guān)系計(jì)算出乳鐵蛋白含量。該法快速準(zhǔn)確，加樣回收率超過96％，檢測(cè)范圍為3.5～100mg/g。該法可以用于嬰兒配方奶粉中乳鐵蛋白的測(cè)定。
　　 以牛初乳作為原料，經(jīng)等電點(diǎn)沉淀和加壓過濾除去酪蛋白，隨后在pH7.5條件下加入乙醇至50％，可以使乳清中的乳鐵蛋白沉淀并獲得粗制品，粗制品經(jīng)低壓液相色譜純化以及切向流超濾脫鹽后可以獲得高純度的乳鐵蛋白，該乳鐵蛋白制品經(jīng)HPLC和HPEC

6、分析，雜質(zhì)含量均已低于檢測(cè)限度。
　　 在乳鐵蛋白水解工藝的優(yōu)化過程中，使用平行試驗(yàn)法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，借助Mathematic7.01軟件實(shí)施曲面回歸分析初步得出，當(dāng)以蛋白質(zhì)水解程度最大為目標(biāo)時(shí)，胃蛋白酶水解乳鐵蛋白反應(yīng)體系適宜的條件是：底物濃度2％，溫度37℃，pH2.2-2.3，酶用量7U/g.當(dāng)水解反應(yīng)進(jìn)行到60min時(shí)，所得水解產(chǎn)物抑菌活力最強(qiáng)。
　　 在乳清蛋白水解工藝的優(yōu)化過程中，使用SPSS18.0軟件設(shè)計(jì)正交實(shí)

7、驗(yàn)方案，并進(jìn)行單變量一般線性模型的方差分析。使用堿性蛋白酶水解乳清蛋白適宜的工藝參數(shù)為：酶底比5％，pH8.0，溫度45℃。水解產(chǎn)物不對(duì)病原微生物產(chǎn)生抑制作用，但可以促進(jìn)益生菌的生長。
　　 將胰蛋白酶和中性蛋白酶以1:1的比例復(fù)合使用來水解酪蛋白。使用DesignExpert軟件的Box-Behken模塊中的響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案并作回歸分析，發(fā)現(xiàn)在pH7.4，溫度44℃，底物濃度32g/L，酶底比2.5％下，水解90min