半乳糖基甘油脂酶法合成及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、甘油糖脂是自然界中廣泛存在的一類具有明顯的抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化等生物活性的物質(zhì)。尤其是其抗腫瘤活性引起了人們的廣泛關(guān)注。但是天然提取得到的甘油糖脂數(shù)量有限，含量少，純度低;化學(xué)合成或化學(xué)酶法合成甘油糖脂步驟繁瑣，條件苛刻，立體選擇性和區(qū)域選擇性差，副產(chǎn)物多;難以準(zhǔn)確全面地反映甘油糖脂與活性之間真正的構(gòu)-效關(guān)系。本研究旨在建立一種簡(jiǎn)單、高效的半乳糖基甘油脂酶法合成途徑，并對(duì)合成半乳糖基甘油脂的抗腫瘤活性進(jìn)行研究。主要研究?jī)?nèi)容

2、如下:
　　1.以甘油和半乳糖為原料，β-半乳糖苷酶(Kluyveromyces lactis)為催化劑催化反應(yīng)，合成半乳糖基甘油。對(duì)反應(yīng)過程中的多種影響因素進(jìn)行研究（半乳糖苷酶添加量、反應(yīng)時(shí)間、底物摩爾比、溫度、緩沖液比例、緩沖液pH等），然后在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert統(tǒng)計(jì)分析軟件，通過響應(yīng)曲面法對(duì)影響反應(yīng)較大的四個(gè)因素（底物摩爾比率、酶濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化，評(píng)價(jià)指標(biāo)為半乳糖基甘油的產(chǎn)量及半

3、乳糖轉(zhuǎn)化率。得到最優(yōu)反應(yīng)條件為:溫度39.75℃，反應(yīng)時(shí)間48 h，酶濃度為350 U/mL，底物摩爾比為8.65∶1，即甘油為16 mmol，半乳糖為1.85 mmol，在此條件下得到最高產(chǎn)量為140.03±5.87mg/mL，半乳糖轉(zhuǎn)化率為55.71±2.33％,與預(yù)測(cè)值接近，而且產(chǎn)量比單因素實(shí)驗(yàn)（116.47±3.56 mg/mL）提高了20.22％。
　　2.使用顆粒活性炭對(duì)半乳糖基甘油進(jìn)行純化。首先通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)確定了

4、最佳初始吸附濃度為56.77 mg/mL，平衡吸附時(shí)間為1h，最適吸附溫度為20℃。用偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型及顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型對(duì)吸附過程進(jìn)行擬合，結(jié)果表明偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)可以良好的描述活性炭對(duì)半乳糖基甘油的吸附過程，其表觀活化能Ea為62.58kJ/mol，小于83.72 kJ/mol，表明該吸附過程為物理吸附。吸附過程焓變△H為-8.58 kJ/mol小于零，熵變△S為22.48 J/mol·K大于零，說明吸附過程為熵增加的放熱

5、過程，吉布斯自由能△G小于零，說明該吸附過程可自發(fā)進(jìn)行。
　　隨后在靜態(tài)吸附基礎(chǔ)上進(jìn)行動(dòng)態(tài)柱實(shí)驗(yàn)，研究初始上樣濃度、上樣流速對(duì)半乳糖基甘油分離純化的影響，確定在濃度為21.46mg/mL、流速為2.0 mL/min時(shí)，活性炭穿透容量為122.62mg/g（半乳糖基甘油/活性炭）。然后通過梯度洗脫對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行純化，3％乙醇水溶液洗脫過量的底物甘油和半乳糖，收集9％乙醇水溶液洗脫液組分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥后得到半乳糖基甘油純品，回

6、收率為76.95％，純度為98.33％。采用多種MS及NMR方法對(duì)純品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到半乳糖基甘油的分子量為254，結(jié)構(gòu)為關(guān)于甘油2-位的順反異構(gòu)體:(2R)-/(2S)-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-sn-甘油，兩種同分異構(gòu)體的比例為1∶1。得到的產(chǎn)品可以用于后期半乳糖基甘油脂的合成。
　　3.以正己酸和實(shí)驗(yàn)室自制的半乳糖甘油為原料，以脂肪酶Novozyme435為催化劑催化反應(yīng)，合成半乳糖基甘油己酸單酯及二酯。之后進(jìn)行一系列

7、的單因素實(shí)驗(yàn)，研究多種因素對(duì)脂肪酶催化合成半乳糖基甘油己酸酯的影響，從而得到較為合理的反應(yīng)條件:丙酮為溶劑，Novozyme435的添加濃度為20 mg/mL，反應(yīng)時(shí)間為10.5 h，反應(yīng)溫度為50℃，底物摩爾比為1∶18（糖苷∶己酸），糖苷轉(zhuǎn)化率為86.82％。通過萃取和硅膠柱層析來純化產(chǎn)物，首先采用等同比例的氯仿和水對(duì)樣液進(jìn)行萃取，得到水相濃縮液和氯仿相濃縮液分別過硅膠柱層析，以氯仿∶甲醇（體積比為9∶1）進(jìn)行洗脫，水相物質(zhì)為單酯產(chǎn)

8、物，氯仿相物質(zhì)為二酯產(chǎn)物，經(jīng)HPLC-ELSD檢測(cè)純度在95％以上。隨后通過MS及NMR方法對(duì)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，得到半乳糖基甘油己酸單酯的分子量為352，結(jié)構(gòu)為1-O-己酰基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基甘油和3-O-(6'-O-己?；?β-D-半乳糖基)-sn-甘油兩種。得到的半乳糖基甘油己酸二酯的分子量為450，結(jié)構(gòu)為1-O-己?；?3-O-(6'-O-己酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-sn-甘油。
　　4.基于半乳糖基甘油己酸

9、酯的合成方法，進(jìn)一步合成多種半乳糖基甘油脂:C6、C10、C12、C16、C18、C18∶1、C18∶2、C18∶3的單酯和二酯產(chǎn)物;并分別對(duì)上述產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。經(jīng)HPLC-ELSD檢測(cè)純度大于95％，采用MS鑒定其分子量。隨后將含有不同脂肪酸鏈的半乳糖基甘油脂作用于人正常細(xì)胞293T和腫瘤細(xì)胞A549、BGC-823、HepG2、MCF-7，進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，半乳糖基甘油脂的脂?；湆?duì)其活性影響很大，隨著酯?；滈L(zhǎng)的增加