人工構(gòu)建一組可激活的啟動子以用于在釀酒酵母細(xì)胞中設(shè)計生物傳感器.pdf

1、生物傳感器是指能夠?qū)?xì)胞所處環(huán)境中某一種或多種化合物（信號輸入）的存在作出反應(yīng)，并產(chǎn)生某種信號輸出（如熒光）的基因通路。以植物為例，其葉片細(xì)胞的基因正常表達(dá)時，將不斷合成葉綠素，保證植物能夠進(jìn)行光合作用和正常生長。假設(shè)某一化合物X能夠阻遏葉綠素基因的表達(dá)，當(dāng)環(huán)境中存在該物質(zhì)時，作用于植物細(xì)胞中葉綠素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，葉綠素合成將被關(guān)閉，消耗的葉綠素得不到補充，于是葉片顏色趨于黃白。這里，植物細(xì)胞在某種程度上就可以看作是一種生物傳感器。

2、根據(jù)數(shù)字電路的原理，生物傳感器的信號輸入和輸出應(yīng)該只存在兩個值：0（弱信號）或1（強信號）。生物傳感器的數(shù)字電路是按照邏輯門原理逐層相連的。在合成生物學(xué)中，人們通過利用轉(zhuǎn)錄或翻譯機制來實現(xiàn)基因的邏輯運算功能，利用基因功能的激活和關(guān)閉表示信號的強和弱，從而連通基因元件，并構(gòu)成基因電路。本課題初步探索并描述了如何為構(gòu)建基因邏輯門而合成受激活調(diào)控的啟動子，從而為設(shè)計并構(gòu)造復(fù)雜的生物傳感裝置探索方式方法。
　　在基因邏輯門中，與門（邏輯乘

3、法）具有一定的構(gòu)建難度。取兩個信號輸入（i1和i2），當(dāng)且僅當(dāng)i1和i2的值同為1時，與門的輸出值為1；否則輸出值為0.在本課題的設(shè)計背景下，信號輸入為一種或幾種化合物（抗生素、激素等），信號輸出為熒光。對于生物系統(tǒng)來說，與門應(yīng)當(dāng)在兩個信號輸入達(dá)到一定濃度時才輸出強信號1（例如高水平熒光信號）。然而，如果計劃利用該系統(tǒng)來檢測污染物的存在，那么即使較低濃度的污染物的信號輸入也應(yīng)被視為1，因為多數(shù)對環(huán)境和人體有害的物質(zhì)能夠在較低濃度時表現(xiàn)出

4、較大的急性毒性或長期毒性。例如，在食品安全風(fēng)險評估中，評估的結(jié)果常以每日容許攝入量表示，指人或動物每日攝入某種化學(xué)物質(zhì)（食品添加劑、農(nóng)藥和獸藥等），對健康無任何已知不良效應(yīng)的劑量，其單位通常為mg/kg體重或μg/kg體重，對應(yīng)被評估物質(zhì)尤其是污染物的濃度十分低。因此，生物傳感器的構(gòu)建應(yīng)考慮到實際應(yīng)用的前提和環(huán)境，應(yīng)賦予其探測較弱信號輸入的能力，即較高的反應(yīng)敏感性。
　　通常情況下，與門的構(gòu)建是以基因轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)為基礎(chǔ)的，需要使用

5、兩種操縱基因來激活調(diào)控單一啟動子。值得注意的是，與門需要較弱的啟動子來保證只有當(dāng)兩個信號輸入都存在時才產(chǎn)生信號輸出。如果啟動子過強，那么容易在只有一個信號輸入激活基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，產(chǎn)生信號輸出，從而失去了與門的邏輯功能。因此在本課題中，通過人工縮短DNA序列，修改了酵母基因組原有的弱啟動子CYC1，大幅度削弱了其強度，用以構(gòu)造所需要的受激活調(diào)控的合成啟動子。同時，由于AraC和TetR'只能在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，因此需要通過將AraC和Te

6、tR'固有的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域分別與來自病毒的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域VP64相連接，來設(shè)計能夠在酵母細(xì)胞中正常表達(dá)的新型融合蛋白。VP64是VP16的四聚衍生物，國際上已有將VP64與其他DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合并在酵母細(xì)胞中成功表達(dá)的先例。本課題中采用核定位序列NLS和表位標(biāo)簽HAtag序列來連接兩種結(jié)構(gòu)域，NLS的作用是幫助蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，而加入HAtag是為了能夠用Westren Blot檢測蛋白的表達(dá)。然而，在本課題中，兩種融合蛋白的構(gòu)建

7、實驗未能得到預(yù)期的結(jié)果，因此引入了基于LexA的融合蛋白，以保證后續(xù)研究工作的進(jìn)行。
　　本課題中組建并且測試了一系列分別由不同數(shù)量的ara操縱基因、tet操縱基因和lex操縱基因排列構(gòu)成的基因盒子，以分析操縱基因的數(shù)量對于啟動子激活強度的影響，從而選擇合適的基因盒子來進(jìn)行調(diào)控。為了構(gòu)建受兩種信號輸入（四環(huán)素和β-雌二醇）調(diào)控的與門，研究中還嘗試了按一定的順序?qū)煞N不同的操縱基因（tet操縱基因和lex操縱基因）排列組合，以較全面

8、地測試操縱基因數(shù)目和排列順序的不同對轉(zhuǎn)錄調(diào)控產(chǎn)生的影響，為與門的構(gòu)建結(jié)構(gòu)提供更為豐富的選擇。研究中使用酵母增強綠色熒光蛋白作為信號輸出，使用流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)測量熒光強度，以量化描述合成啟動子的強度。
　　由于融合蛋白和受激活啟動子的構(gòu)建工作都涉及基因線路中基本元件（DNA序列）的組裝，因此需要選擇快速有效的DNA組裝方法。在本課題中使用了兩種不同的DNA組裝方法：Gibson法和MoClo法。這兩種方法都采用一步反應(yīng)技術(shù)，也就是

9、說能夠在一次實驗中同時組裝多個DNA片段。Gibson法需要提前配置酶反應(yīng)體系，參照載體質(zhì)粒的酶切端口序列設(shè)計恰當(dāng)?shù)囊?，利用PCR擴增目的基因片段的同時，在其兩端擴展與載體質(zhì)粒端口互補的識別序列。其準(zhǔn)備工作較為簡單，利用該法插入單一片段較為方便，但同時按順序連接多個基因片段的能力不如MoClo法。MoClo法是基于Golden Gate組裝的一種基因整合策略，該法通過交替利用兩種限制性內(nèi)切酶的酶切位點，將復(fù)雜基因組裝工作分成了三個水平

10、。即利用BpiI酶切插入單一基因片段的0級反應(yīng)，利用BsaI再次酶切將包含0級組件的各個質(zhì)粒按序連接并插入下一級載體的1級反應(yīng)，以及最后再次利用BpiI酶切將包含1級組件的各個質(zhì)粒按序連接并插入最終載體的2級反應(yīng)。最終得到的質(zhì)粒分子將包含完整的目的轉(zhuǎn)錄單元。
　　本課題偏重于以MoClo法為主要技術(shù)基礎(chǔ)，在其原理指導(dǎo)下，分級逐步改造了pRSⅡ質(zhì)粒系統(tǒng)（廣泛應(yīng)用于釀酒酵母細(xì)胞）。建立了包含0級、1級和2級在內(nèi)的多個空載體，并將所需目

11、的基因片段逐層插入和整合，使其能夠執(zhí)行受激活啟動子、融合蛋白、完整轉(zhuǎn)錄單元乃至小型基因線路（與門）的復(fù)雜組裝。隨后將得到的合成質(zhì)粒整合進(jìn)入酵母基因組DNA，利用釀酒酵母細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)。在課題后期，使用β-雌二醇濃度梯度對酵母細(xì)胞進(jìn)行了誘導(dǎo)，經(jīng)過反復(fù)實驗，得出了較為理想的受激活啟動子所調(diào)控的熒光基因表達(dá)強度關(guān)于β-雌二醇濃度的變化趨勢。低于3.1nM/L時，熒光強度隨β-雌二醇濃度升高而顯著增加；而高于3.1nM/L時，β-雌二醇表現(xiàn)出

12、了明顯的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致酵母細(xì)胞正常生長繁殖受抑制，基因表達(dá)異常，故其熒光強度趨近于陰性對照菌株。
　　融合蛋白構(gòu)建的失敗，可能是由于轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域VP64與固有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的連接方式不當(dāng)，影響了蛋白質(zhì)的正常折疊。故而在實驗室未來的工作中，如何將原本只能在細(xì)菌中工作的AraC和TetR'與VP64或其他可用的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域恰當(dāng)?shù)倪B接，保證其正確的折疊并行使原有的功能，將成為主要研究目標(biāo)之一。
　　在本課題研究中所構(gòu)建的各類