伊拉兔耳糖胺聚糖的提取分離、結(jié)構(gòu)表征及其生物活性評(píng)價(jià).pdf

1、以伊拉兔耳為原料,分別從兔耳軟骨中提取硫酸軟骨素(CS)、從兔耳皮中提取硫酸皮膚素(DS)。
　　將兔耳褪毛、去肉,剝皮后分別得新鮮兔耳軟骨和兔耳皮,經(jīng)脫脂、加熱蒸煮、5％胰蛋白酶37℃下酶解12h、乙醇沉淀回收得到兔耳軟骨粗多糖MT1和兔耳皮粗多糖RS,收率分別為15.2%和1.51%。醋酸纖維素薄膜電泳(CAME)結(jié)果顯示MT1和RS均屬于CS類(lèi),MT1與CSA標(biāo)品遷移率最為接近。單糖組成分析結(jié)果則表明MT1中含半乳糖胺(Ga

2、lN)和葡萄糖醛酸(GlcA)較多,且摩爾比約為1∶1;而兔耳皮粗多糖中含IdoA,證明了硫酸皮膚素(DS)的存在。
　　通過(guò)QFF陰離子交換樹(shù)脂對(duì)粗品進(jìn)行分離純化,MT1分別以0、0.7、0.8和0.9 mol/LNaCl溶液洗脫,得到4個(gè)組分MT-A、MT-B、MT-C和MT-D,其中MT-C和MT-D收率較高,分別為37.0%和24.5%;RS以0、0.4、0.7、0.8和0.9 mol/L NaCl溶液洗脫,得到RS-A、

3、RS-B、RS-C、RS-D和RS-E5個(gè)組分,其中RS-C、RS-D和RS-E收率較高。
　　用醋酸纖維素薄膜電泳檢測(cè)各純化組分的種類(lèi)和純度,MT-C、MT-D電泳條帶單一,電泳遷移率與CSA標(biāo)準(zhǔn)品接近;RS-C、RS-D和RS-E的電泳遷移率與 CS類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品接近。用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)與十八角激光散射儀(MALLS)聯(lián)用在線檢測(cè),結(jié)果顯示MT-C、MT-D和RS-E色譜峰均單一對(duì)稱(chēng),經(jīng)計(jì)算其重均分子量(Mw)分別為2

4、3.5kDa、41.1kDa和25.2 kDa,MT-C、MT-D的分子量分布寬度比CSA標(biāo)準(zhǔn)品更小,RS-E的的分子量分布寬度比CSB標(biāo)準(zhǔn)品更小。
　　用軟骨素酶ABC降解的方法分析二糖組成,薄層色譜(TLC)結(jié)果表明, MT-C和MT-D可被完全降解;高效液相色譜(HPLC)數(shù)據(jù)分析可知MT-C和MT-D的Δdi4S/Δdi6S值分別為2.21和4.58,較CSA標(biāo)準(zhǔn)品(1.38)高,且含少量的Δdi0S和ΔdiSD;對(duì)于兔耳

5、皮多糖,TLC結(jié)果和HPLC數(shù)據(jù)則表明,RS-C屬于CSC,RS-D屬于CSA,RS-E則屬于DS,二糖單位以Δdi4S為主,含IdoA的二糖單位與含GlcA的二糖單位的比例約為1∶1,且含少量的ΔdiSB和ΔdiSD。紅外光譜(IR)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明MT-C、MT-D和RS-E的硫酸根取代大多在C4位上;13C-NMR結(jié)果顯示MT-1和MT-2這兩種CSA雜峰少、純度高,GalNAc以C-4位硫酸化為主。以上結(jié)果表明MT-C和MT-D均

6、是以ΔGlcA-GalNAc4S為主要二糖組成單位,并含有部分ΔGlcA-GalNAc6S和ΔGlcA-GalNAc、少量ΔGlcA2S-GalNAc6S的高純度CSA;而RS-E是一種二糖單位以ΔUA-GalNAc4S為主、且ΔIdoA-GalNAc4S與ΔGlcA-GalNAc4S的摩爾比約為1∶1、且含部分ΔUA2S-GalNAc4S和少量的ΔUA2S-GalNAc6S與ΔUA-GalNAc的高純度DS。
　　在結(jié)構(gòu)研究基礎(chǔ)

7、上,對(duì)兔耳軟骨多糖、兔耳皮多糖進(jìn)行BaF3細(xì)胞增殖活性評(píng)價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn)MT-D、RS-E有一定的促細(xì)胞增殖活性,表明其與FGFR1、FGF2有一定的結(jié)合能力;以APTT、TT和PT為指標(biāo),對(duì)軟骨多糖、純化組分磺化樣品SMT-C、SMT-D以及兔耳皮多糖的抗凝活性進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果表明,SMT-C、SMT-D和RS-E有一定的抗凝活性,且主要是通過(guò)內(nèi)源性途徑引起的。SMT-C、SMT-D的抗凝活性好于 MT-C、MT-D,說(shuō)明硫酸根是抗凝活性的

8、促進(jìn)基團(tuán)。并探討了兔耳多糖對(duì)纖溶系統(tǒng)的影響,其中 MT-C與 MT-D對(duì) u-PA、t-PA和t-PA/PAI-1的提高作用較為顯著,具有促血栓溶解的潛力。
　　總之,本研究系統(tǒng)建立了從兔耳中提取分離純化糖胺聚糖工藝,首次從中獲得新型硫酸軟骨素和硫酸皮膚素,并對(duì)其細(xì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,填補(bǔ)了兔耳軟骨、兔耳皮多糖研究空白,為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。此外,兔耳軟骨來(lái)源的硫酸軟骨素具有較好的促血栓溶解活性,兔耳皮來(lái)源的硫酸皮膚素具有較