類彈性蛋白修飾R型ω轉(zhuǎn)氨酶用于催化R苯乙胺.pdf

1、R型ω轉(zhuǎn)氨酶是指立體選擇性地催化R型胺發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng)且底物或產(chǎn)物沒(méi)有α-氨基酸或α-酮酸的一類酶，在輔酶5'-磷酸吡哆醛(PLP)的輔助下完成整個(gè)氨基互換催化過(guò)程。R型ω-轉(zhuǎn)氨酶在被用來(lái)拆分和合成手性胺上得到廣泛研究和應(yīng)用。本課題從來(lái)源于Arthrobacter sp.KNK168中的R型ω-轉(zhuǎn)氨酶基因片段出發(fā)，構(gòu)建多個(gè)載體，進(jìn)行表達(dá)純化，探究了多酶體系在催化R-苯乙胺上的應(yīng)用。
　　首先，本課題通過(guò)基因方法構(gòu)建了R型ω-轉(zhuǎn)氨酶的p

2、ET28a-RTA表達(dá)載體，為了用更簡(jiǎn)易更低成本的方法進(jìn)行純化，本課題引入了類彈性蛋白純化標(biāo)簽10倍體ELP，構(gòu)建了表達(dá)載體pET28a-10ELP-RTA。對(duì)比酶活發(fā)現(xiàn)，單酶RTA酶活和10ELP-RTA的酶活非常接近，說(shuō)明ELP并沒(méi)有影響RTA的酶活。從圓二色譜的結(jié)果也可以看到兩種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似。
　　隨后，為了在丙酮酸不足的條件下使反應(yīng)平衡向正向移動(dòng)，利用DAAO催化副產(chǎn)物D-Ala反應(yīng)生成丙酮酸，從而實(shí)現(xiàn)丙酮酸循環(huán)，本

3、課題在反應(yīng)體系中引入了DAAO構(gòu)建雙酶反應(yīng)體系。從轉(zhuǎn)化率結(jié)果來(lái)看:RTA單酶轉(zhuǎn)化率較低，而雙酶體系13h的轉(zhuǎn)化率高達(dá)99.6％。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡表征R-苯乙胺呈現(xiàn)微米級(jí)的液滴，ELP-RTA也發(fā)生微米級(jí)大小的自聚，但當(dāng)R-苯乙胺和ELP-RTA，ELP-DAAO組成的雙酶體系混合時(shí)就形成了類似網(wǎng)狀的形態(tài)，結(jié)合轉(zhuǎn)化率結(jié)果，雙酶的網(wǎng)狀形態(tài)有利于反應(yīng)達(dá)到雙酶引發(fā)的緊密而連續(xù)催化效果。單一的酶系統(tǒng)，在反應(yīng)介質(zhì)中，ELP-RTA自組裝形成微米

4、大小的酶集群，底物R-苯乙胺也形成了微米大小的液滴。酶集群和底物液滴的親密接觸提供了高底物濃度的微環(huán)境來(lái)接近酶，促進(jìn)底物分子的擴(kuò)散到活性位點(diǎn)。對(duì)于雙酶系統(tǒng)，ELP-RTA和ELP融合DAAO組裝形成雙酶復(fù)合物，形成集群的幅度比單一酶大得多，大大地提高了轉(zhuǎn)化率。
　　最后，利用DAAO催化D-Ala的反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸和H2O2，而CAT可以又將H2O2分解成H2O和O2，應(yīng)用構(gòu)建的內(nèi)含肽介導(dǎo)的RTA-DAAO和CAT-DAAO雙酶剪接