內質網鈣釋放與內皮型一氧化氮合酶在血管內皮調節(jié)中的作用和機制.pdf

1、一氧化氮（nitric oxide，NO)既兼有第二信使和神經遞質的功能，又是效應分子，介導和調節(jié)多種生理和病理過程[1，2]。NO的調節(jié)功能十分廣泛，除了舒張血管，它還在血小板聚集，血管生成，血管平滑肌細胞的增值等方面發(fā)揮作用[3，4]。當內皮要向肌肉發(fā)出放松指令以促進血液流通時，就會產生小分子NO，它能很容易地穿過細胞膜，血管周圍的平滑肌細胞接收信號后舒張，從而導致血管擴張。因此，正常生理條件下，NO在維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面起著十分

2、重要的作用[5]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在幾乎所有病理條件下，都伴隨著內皮功能紊亂以及NO含量的異常[6]。人體內NO主要來源于一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS），其同功酶有三種亞型，即在正常狀態(tài)下表達的內皮型一氧化氮合酶（eNOS）[7]，神經元型一氧化氮合酶（nNOS）[8]以及在損傷后誘導表達的誘導型一氧化氮合酶（iNOS）[9]。作為水溶性可擴散的氣體分子，NO在心血管系統(tǒng)不能像其他信號分子一樣儲存在

3、細胞器。它的產生取決于eNOS的活化，其信號強度和作用時間長短很大程度上取決于eNOS的功能狀態(tài)。因此，eNOS的激活與調控機制已經成為國際上心血管領域的研究熱點。經典理論認為，eNOS需要在鈣調蛋白（CaM）結合變構之后才能活化,而后者需要在Ca2+濃度升高的條件下發(fā)生變構才能與eNOS結合[10，11]。細胞內Ca2+來源有兩條途徑：（1）、乙酰膽堿、緩激肽等激動劑與細胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體結合，鈣通道開放，胞外Ca2+流入胞漿[1

4、2]；（2）、ATP結合內質網P2Y受體，促進鈣庫Ca2+釋放[13]。細胞漿內Ca2+濃度升高，CaM與Ca2+結合形成Ca2+/CaM復合物，eNOS與后者結合后構象變化，使得電子流可以從還原亞基轉移至氧化亞基，催化NO的生成。除了Ca2+調控之外,蛋白質的磷酸化修飾在eNOS活性調控中也起著非常重要的作用[14]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，eNOS在絲氨酸和蘇氨酸殘基上容易被磷酸化，已知的對eNOS功能起關鍵作用的是Ser1179/117

5、7(牛、人)[15，16]。目前報導的激酶包括Akt、AMPK、PKG、CaKII等都能夠磷酸化該位點，許多胞外刺激信號都可磷酸化該位點而激活eNOS[4]。與此同時，Ser635是eNOS的另一個重要磷酸化位點，在機械剪切力作用下，PKA對Ser635位點的磷酸化顯著地增強了eNOS活性[17]。與上述兩個位點磷酸化均可增強eNOS活性相反的是，由PKC激活的Thr497的磷酸化能夠降低eNOS的酶活性[18-20]。除了Ser117

6、9/Ser635/Thr497之外，其它被報導的磷酸化位點還有Ser116和Ser617。相對于前三個位點來說，Ser116和Ser617位點磷酸化對于eNOS功能的影響還有待進一步研究。盡管Ca2+和蛋白質磷酸化修飾這兩種因素在調控eNOS活性方面都起著重要的作用，但它們二者之間的相互作用目前知之甚少。我們前期的工作和最新研究資料表明：盡管CaM的結合對于eNOS活化及其重要，但是二者的結合是否一定需要高濃度的Ca2+呢？這取決于eN

7、OS磷酸化的狀態(tài)。例如，在靜息水平的Ca2+濃度下，Ser1179/Ser635位點的磷酸化能夠激活eNOS[15，16，21]。顯然，正是因為這兩個位點的磷酸化增強了eNOS與CaM之間的親和力[22]。另一方面，細胞內的Ca2+位移如何影響eNOS的磷酸化呢？目前仍不清楚。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)TG（Thapsigargin）刺激BAEC和HUVEC兩種細胞，引起eNOS活化，產生NO增加現(xiàn)象。進一步研究發(fā)現(xiàn)，eNOS在Ser6

8、35位點特異性磷酸化，并且呈現(xiàn)時間和劑量依賴性，在半小時點達到峰值，同時我們發(fā)現(xiàn)這種激活作用與細胞外液Ca2+無關。因此，我們推測可能是細胞動員了鈣庫中的Ca2+，導致細胞漿中Ca2+濃度升高，從而激活了eNOS。通過進一步分析，我們使用了不同的鈣釋放劑，包括Bradykinin和ATP同樣檢測到了eNOS在Ser635位點的特異性磷酸化，使用細胞內鈣抑制劑Bapta-AM有效阻止了該磷酸化修飾。這進一步證明了我們的猜測：細胞內Ca2+

9、濃度升高導致了eNOS磷酸化。接著，我們探究了細胞內Ca2+濃度升高與eNOS磷酸化二者之間的關系和信號轉導機制。據現(xiàn)有報導，許多刺激信號能夠通過PKA、CaMKII等信號途徑在eNOS的Ser635位點進行磷酸化修飾，從而活化eNOS,增強其產生NO的能力。我們的研究顯示：PKA的特異性抑制劑PKI、H89以及CaMKII的特異性抑制劑KN93均不能阻止eNOS在Ser635位點特異性磷酸化。而使用ERK1/2的特異性抑制劑PD980

10、59和U0126均可完全阻止eNOS在Ser635位點特異性磷酸化。這些結果表明：eNOS在Ser635位點特異性磷酸化機制與PKA、CaMKII無關，而是由ERK1/2信號轉導通路所介導。綜上所述，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)了內質網鈣釋放激活了eNOS在Ser635位點特異性磷酸化，增強了eNOS的酶活性。同時，我們揭示了該信號通路系由上游激酶ERK1/2介導的生化機制。并且，我們進一步闡述了在生理條件下，ATP通過ERK1/2信號途徑對Se