抗核抗體及抗雙鏈DNA抗體熒光免疫層析法快速篩查試劑盒的研究.pdf

1、目的:本課題在當今檢驗醫(yī)學發(fā)展提出的POCT(PointOf Care Testing)，即即時檢驗新領域背景下，致力于開發(fā)一種新的檢測試劑即熒光免疫層析快速檢測試劑盒，使用小型熒光免疫分析儀進行檢測，花費時間在15分鐘左右，因此簡單、便捷，標本即到即檢，既能解決病人等待時間長之問題，又能解決臨床醫(yī)生執(zhí)行自身免疫性疾病臨床診斷的路徑問題，可以在各級醫(yī)院臨床推廣使用，以提高自身免疫疾病的診治水平。
　　熒光免疫層析檢測法是一種將免疫

2、側向層析技術、鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)和熒光檢測技術三者結合起來的一種檢測技術，該技術首次將熒光蛋白作為其標記物并結合了鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)，不僅提高了快速檢測的穩(wěn)定性也提高了試劑檢測的靈敏性。同時檢測速度快，整個分析過程只需要十五分鐘左右。這種技術是課題組的多項專利技術融合，將它用于抗核抗體的快速篩查檢測試劑盒的研發(fā)，可以填補抗核抗體的快速篩查領域中的空白。
　　綜上所述，本課題擬采用熒光免疫層析法用熒光免疫分析儀來檢測

3、血清標本中ANA及dsDNA，開發(fā)快速檢測試劑盒，可用于AID的早期篩查和病情監(jiān)控。
　　方法:1、抗原的制備、純化、鑒定及固化
　　1.1、抗原制備、純化、鑒定:
　　根據(jù)自身免疫性抗原自身特點采取有效的方法（如基因工程合成、質粒提取DNA等）制備抗原，純化后利用商品化的單克隆抗體檢測試劑盒和確診為相關自身免疫疾病且ANA或dsDNA陽性的血清進行驗證，以驗證制備的抗原是否合格，然后進一步純化濃縮，保證靶抗原的豐度與

4、純度。最后鑒定經(jīng)過純化濃縮處理后的抗原是否符合進一步研究的要求。
　　1.2、抗原固化:
　　以PBS緩沖液系統(tǒng)稀釋提取抗原至合適濃度，固定于NC膜上;加入待測不同稀釋度的陽性標本，根據(jù)熒光強度調整緩沖液成分。對固化過程中的環(huán)境條件，分別在濕度45％、50％、55％和60％進行，以劃線粗細均勻，無明顯擴散、無明顯疏水斑為佳;在穩(wěn)定性能上，分別保存1、3、5、7、10天，用陽性標本檢測比較熒光強度。
　　2、熒光蛋白與抗

5、體的結合
　　生物素標記鼠抗人IgG抗體:用PBS溶液將待標記抗體稀釋至相應濃度，放入適當?shù)碾x心管中;DMF將生物素溶解至相應濃度，加入待標記抗體中，充分反應后，根據(jù)反應體系大小，加入一定量的0.1M的NH4Cl，終止標記。4℃透析除去多余的生物素和NH4Cl，透析好的標記抗體放入-20℃長期保存，或4℃保存近期實驗備用。
　　鏈霉親和素標記熒光蛋白:從GeneBank中調取鏈霉親和素基因sa、藻藍蛋白β亞基cpcB、裂合酶

6、基因alr0617、藻紅膽素合成酶基因ho1、pebA和pebB的序列，設計引物，以藻總DNA作為模板進行PCR擴增獲取目的片段轉入質粒，選擇同時攜帶鏈霉親和素與藍藻蛋白cpcB的融合基因，以及Histag標簽。通過培養(yǎng)含有質粒的大腸工程菌，進行融合蛋白的表達，鑒定及純化，獲取鏈霉親和素標記熒光蛋白。
　　熒光蛋白與抗體結合能力檢測:將生物素標記鼠抗人IgG抗體包被在96孔板，加入一定濃度的鏈霉親和素標記熒光蛋白，通過微孔板檢測儀

7、檢測熒光強度檢測鏈霉親和素標記熒光蛋白與鼠抗人IgG抗體結合能力。
　　3、測試卡的制備及組裝
　　(a)樣品墊，以玻璃纖維膜為載體，經(jīng)樣品墊處理液浸泡處理，烘干;(b)熒光蛋白結合墊，以玻璃纖維膜為載體，經(jīng)結合墊處理液浸泡處理，烘干，將熒光蛋白經(jīng)緩沖液稀釋后，均勻噴在纖維膜上，烘干;(c)生物素化鼠抗人IgG抗體結合墊，以玻璃纖維膜為載體，經(jīng)結合墊處理液浸泡處理，烘干，將生物素化鼠抗人IgG抗體經(jīng)緩沖液稀釋后，均勻噴在纖維

8、膜上，烘干;(d)NC膜，結合有檢測用固相抗原（檢測線T）和質控用IgG抗體（質控線C;本研究dsDNA系統(tǒng)用羊抗兔IgG、ANA系統(tǒng)用羊抗鼠IgG），分別將抗原和羊抗兔（鼠）IgG抗體經(jīng)緩沖液稀釋后，用劃膜儀均勻劃至NC膜上，烘干;(e)吸水墊(f)底板，PS底板，帶有不干膠，作為各成分粘貼的載體;上述(a)-(e)組分按順序和層疊次序粘貼于PS底板上，切為4mm寬條狀，得到測試條;(g)卡殼:依據(jù)測試條的組分分布設計模具，塑料成型制

9、成卡殼;將測試條裝入其中，完成測試卡制備。
　　4、試劑盒反應條件優(yōu)化及性能評價
　　通過優(yōu)化篩選合適的抗原抗體，優(yōu)化抗原抗體反應濃度、反應時間、緩沖液體系、加樣體積等參數(shù)，提高試劑盒準確性、精密度、靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，并形成穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝。對試劑盒進行性能評價，主要指標為:線性范圍、精密度、靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。通過現(xiàn)有檢測方法和研制的快速篩查測試卡檢測結果相比較，評價結果的一致性，評價抗核抗體快速篩查試劑盒的臨床使

10、用效果。
　　結果:1、抗ds-DNA抗體檢測試劑盒研制開發(fā)
　　1.1、生物素標記dsDNA抗原(Biotin-dsDNA)的制備:選擇pGEM-T載體，pb3433，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)18h集菌后用堿裂解法提取其質粒DNA。使用限制性核酸內(nèi)切酶將dsDNA切成具有粘性末端（游離氨基-NH2）的線性dsDNA，按照5mg/mL生物素酰肼水溶液∶5％戊二醛∶dsDNA水溶液=5∶6∶10比例混合攪勻，通過化學交聯(lián)劑把活化的BS

11、A與具有游離氨基的線性dsDNA連接，形成dsDNA-BSA包被抗原。
　　1.2、熒光探針制備:選擇Merck Millipore Corporation公司的熒光微球，完成鼠抗人IgG與熒光微球偶聯(lián)優(yōu)化，最終確定將活化好的熒光微球調節(jié)pH值到7.2-7.4，加入抗體∶微球比例為1∶6，30℃反應30min性能為最佳。
　　1.3、反應條件優(yōu)化、性能評價及臨床比對分析:確定樣本稀釋比例為1∶49（稀釋50倍）本底抗干擾能力

12、及靈敏度陰陽性符合率最佳。其檢測范圍為5.0-600.0IU/mL。批內(nèi)精密度為8.50％，批間精密度為8.58％，分析靈敏度（檢測低限）為3.22IU/mL，測試條穩(wěn)定性在2～8℃環(huán)境里可存放12個月。通過樣本測試比對分析，與廣州南杰生物技術有限公司抗雙鏈DNA抗體定量檢測試劑盒（ELISA方法）之間具有很好的一致性，符合率＞95％，其可較好的滿足臨床使用的要求。
　　2、抗核抗體六聯(lián)檢測試劑盒研制開發(fā)
　　2.1、抗原制

13、備:通過基因合成所需的蛋白類核抗原，并成功進行表達鑒定。
　　在NCBI上查詢臨床常見的人自身抗原的堿基序列和氨基酸序列，運用軟件預測抗原表位，選擇抗原表位并對密碼子進行偏嗜性改造，采用人工合成方法合成抗原表位序列并插入至原核表達載體pET30a中。將重組質粒導入大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導表達，表達的重組蛋白用鎳離子親和層析柱純化，用熒光免疫法測定重組蛋白活性。
　　2.2、抗原固定:對6種抗原52-kD Ro/SSA、

14、rRNP、Jo-1、SmD1、Scl-70 SSB-La進行固定，6種抗原按1∶1∶1∶1∶1∶1混合均勻，在50℃烘箱烘干6小時，固定效果最佳。
　　2.3、熒光探針制備:鼠抗人IgG生物素標記條件優(yōu)化，確定生物素:標記抗體=0.25∶1，30℃水浴30min，PH=7.2-7.4標記效果最穩(wěn)定。對生物素標記抗體濃度及熒光蛋白濃度比例進行了調試，確定了最佳的配比濃度（生物素標記抗體濃度為0.4ug/mL∶熒光蛋白濃度為0.6U/

15、L）30℃反應30min性能為最佳。
　　結論:1、本課題分析基因組雙鏈DNA由于分子量過大容易導致NC膜層析堵塞，樣本無法層析;而進行酶切處理容易導致分子大小不均一，批間差異可控度低等情況，最后選取低分子量的質粒為標記對象，采取堿裂解法提取。其純度高，分子大小均一，批間重復性可控性好。再經(jīng)過純化、鑒定及固化、熒光蛋白與抗體的結合、測試卡的制備及組裝、試劑盒反應條件優(yōu)化及性能評價四項研究后成功研制了抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體

16、檢測試劑盒（熒光免疫層析法）。該方法可以在15分鐘內(nèi)完成檢測。確定樣本稀釋比例為1∶49（稀釋50倍）本底抗干擾能力及靈敏度陰陽性符合率最佳。其檢測范圍為5.0-600.0IU/mL。批內(nèi)精密度為8.50％，批間精密度為8.58％，分析靈敏度（檢測低限）為3.22IU/ml，試紙條穩(wěn)定性盒在2～8℃環(huán)境里可存放12個月。通過樣本測試比對分析，與廣州南杰生物技術有限公司抗雙鏈DNA抗體定量檢測試劑盒（ELISA方法）之間具有很好的一致性，

17、符合率達到95％，其可較好的滿足臨床使用的要求。
　　2、應用基因工程方法利用原核表達系統(tǒng)成功表達了人自身抗原52-kDRo/SSA，rRNP，Jo-1，SmD1，Scl-70以及SSB-La等六種抗原。再經(jīng)過純化、鑒定及固化、熒光蛋白與抗體的結合、測試卡的制備及組裝、試劑盒反應條件優(yōu)化等初步研制了抗核抗體六聯(lián)免疫層析檢測方法。該方法可以在15分鐘內(nèi)完成檢測。確定樣本稀釋比例為1∶99（稀釋100倍）本底抗干擾能力及靈敏度陰陽性符