基于適配體核酶催化的微流控化學(xué)發(fā)光法在微量分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、核酸適配體因其高特異性的配體結(jié)合能力以及優(yōu)良的化學(xué)性質(zhì)，是生物傳感器理想的識別器件;具有辣根過氧化物酶活性的DNA酶，因具有易于復(fù)制、合成及儲存等優(yōu)良特性，有望成為生物傳感器理想的信號報告器件。因此，將適配體與DNA酶組合而成的適配體核酶生物傳感器在生化分析領(lǐng)域有著很大的應(yīng)用前景。本論文共分為五章:
　　第一章為緒論部分，簡要介紹了核酸適配體生物傳感器分類，核酸信號放大技術(shù)以及核酸軟件平臺在適配體生物傳感器設(shè)計方面的應(yīng)用;著重總結(jié)

2、了以G四聯(lián)體DNA酶為報告元件的適配體傳感器（適配體核酶傳感器）的設(shè)計策略，并針對當(dāng)前所發(fā)展的適配體核酶傳感器存在的相關(guān)不足點，提出了本論文的研究內(nèi)容。
　　第二章開展了適配體核酶傳感器的傳感機(jī)理研究并發(fā)展了一種基于微流控化學(xué)發(fā)光法檢測腺苷的新方法。通過構(gòu)建一組擁有相同Watson-Crick堿基配對數(shù)及相近熱力學(xué)穩(wěn)定性的腺苷適配體核酶傳感器，首次從熱力學(xué)平衡移動的角度研究了傳感器高背景信號產(chǎn)生的機(jī)理。通過結(jié)合紫外可見光譜，凝膠電

3、泳等手段，發(fā)現(xiàn)核酸序列的排布策略以及溶液中陽離子的種類含量對與傳感器信號直接關(guān)聯(lián)的Watson-Crick與Hoogsteen二級結(jié)構(gòu)物種的轉(zhuǎn)變起著重要的調(diào)控作用。結(jié)合微流控化學(xué)發(fā)光法的優(yōu)勢，發(fā)展了一種低試劑耗量（2μL）、高通量(60h-1)、高靈敏（絕對檢測限12pmol）、高特異性的腺苷分析方法。
　　第三章以阿爾茲海默癥相關(guān)的基因片段rs242557為研究對象，通過NUPACK軟件預(yù)測toehold長度對鏈置換反應(yīng)影響的研

4、究，設(shè)計了具有高特異性的雙鏈探針，并結(jié)合基于DNA酶增敏的微流控化學(xué)發(fā)光分析法，發(fā)展了一種檢測SNP的新方法。當(dāng)不存在目標(biāo)基因時，由于富G的核苷酸序列被掩蔽在Watson-Crick雙鏈結(jié)構(gòu)中，無法形成具有過氧化物酶活性的DNA酶。當(dāng)體系加入目標(biāo)基因后，可通過引發(fā)鏈置換反應(yīng)解開該雙鏈結(jié)構(gòu)，釋放DNA酶以催化雙氧水氧化魯米諾，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。該方法不僅具有設(shè)計簡單、免標(biāo)記、檢測通量高等優(yōu)點，而且在僅消耗2μL試樣的條件下，實現(xiàn)單堿基突變

5、的rs242557目標(biāo)基因的SNP分析（區(qū)分因子達(dá)56），正常目標(biāo)基因的檢測限達(dá)1.7nmol/L。
　　第四章采用基于toehold誘導(dǎo)DNA鏈置換反應(yīng)的放大策略并結(jié)合DNA酶增敏的微流控化學(xué)發(fā)光法的優(yōu)勢，建立了一種簡便靈敏、無酶無標(biāo)記檢測與阿爾茲海默疾病密切相關(guān)的基因片段rs242557的新方法。體系不存在待測基因時，兩個具有互補(bǔ)序列的寡核苷酸發(fā)夾(H1、H2)共存于溶液中;待測基因的加入能夠催化發(fā)夾的自組裝以及DNA酶的富集