普魯士藍修飾的馬脾鐵蛋白的類酶活性及其在免疫組化檢測中的應用.pdf

1、生物酶在臨床診斷、生物分析等領域都有重要的應用，雖然已經(jīng)被廣泛商品化，但是存在成本高、保存困難等缺點。納米結構的模擬酶由于易于制備、成本低、穩(wěn)定并且催化活性高，已經(jīng)成為納米研究領域中的一個熱點。近年來，普魯士藍納米顆粒(Prussianbluenanoparticles，PBNPs)在模擬酶領域受到了廣泛的關注，由于具備較低的氧化還原電位和良好的電子傳遞能力，PBNPs被認為是一種高性能的人工模擬酶，從而在電化學生物傳感器的組建中得到了

2、廣泛的應用。
　　 鐵蛋白(ferritin)是一種由24個單位結構相似的亞基自組裝形成的納米尺度的蛋白質(zhì)，由外部的蛋白質(zhì)殼層和內(nèi)部的以水合氧化鐵為主要成分的鐵核組成。它是一種天然的納米結構，具有特殊的生物功能。各種天然的鐵蛋白(含鐵)和重組鐵蛋白(無鐵)已經(jīng)被使用作為模板來合成各種納米顆粒，如磁性Fe3O4納米顆粒、半導體CdS量子點、Au原子團簇、Pt納米顆粒，等等。雖然人類、馬、牛蛙和細菌等的鐵蛋白在一級結構上有很大的差異

3、，但是本質(zhì)上它們擁有相同的體系結構，所以其他機體的鐵蛋白應該和人類的鐵蛋白具有相同的功能。研究發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤細胞表面大量表達鐵蛋白特異性受體，從而通過鐵蛋白受體-鐵蛋白的結合介導對鐵蛋白的內(nèi)吞作用。有報道指出，重鏈鐵蛋白(HFt)的受體是轉鐵蛋白受體1(Transferrinreceptor-1，TfR-1)，在腫瘤組織中，TfR-1的表達量遠遠高于健康組織及癌周組織，這就使得鐵蛋白在腫瘤的診斷和治療中有很大的應用潛力。
　　

4、本文中，我們設計了一種新的基于天然鐵蛋白模板的合成方法，無需去除內(nèi)部氧化鐵核。實驗利用酸性條件下亞鐵氰化鉀在氧化鐵核表面的沉積反應，從而得到了小尺寸的普魯士藍納米顆粒同時保留了蛋白質(zhì)殼的生物學特性。我們將這種復合結構命名為普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒(Prussianbluemodifiedferritinnanoparticles，PB-FtNPs)。
　　 (1)通過溫度、pH以及反應物比例的調(diào)控，實現(xiàn)了對PB-FtNPs的

5、尺寸和形貌的控制，并確定了溫度4℃、pH3.0、亞鐵氰化解/鐵蛋白摩爾比0.75∶1為最佳合成條件。用紫外可見光吸收譜、TEM、DLS等進行表征，從而表明了普魯士藍的存在和蛋白質(zhì)結構的完整。酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linkedadsorptionassay，ELISA)證明了在PB-FtNPs中，蛋白質(zhì)仍然具有特異性。對PB-FtNPs和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)修飾過的普魯士藍納米粒子的穩(wěn)定性研究表明，PB-FtNPs更加穩(wěn)定，

6、這可能是由于蛋白質(zhì)殼對普魯士藍的包覆作用。
　　 (2)選取了分別帶有正電荷和負電荷的色原底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，以PB-FtNPs代替酶催化H2O2氧化色原底物從而引起顏色變化，驗證了其具有過氧化物酶活性。米氏動力學分析結果表明，PB-FtNPs比尺寸相近的Fe3O4納米粒子具有更強的催化能力(高1～2個數(shù)量級)。類酶活性對pH、溫度和

7、PB-FtNPs濃度有很強的依賴性，對其過氧化物酶活性的pH依賴性檢測中，發(fā)現(xiàn)在中性或堿性條件下該催化活性幾乎喪失。通過溶解氧電極，我們發(fā)現(xiàn)在pH達到中性和堿性，PB-FtNPs具有類過氧化氫酶活性，可以催化H2O2分解產(chǎn)生氧氣。
　　 (3)免疫組化實驗結果表明，PB-FtNPs對于胃癌、食管癌和乳腺癌具有特異性檢測的能力，分別達到29/30(96.7％)、29/31(93.5％)和71/92(77.2％)的靈敏度，研究了鐵蛋