維生素C混菌發(fā)酵體系蛋白與代謝組學研究.pdf

1、由Ketogulonicigenium vulgare與Bacillus構(gòu)成的微生物混菌體系，在維生素C的工業(yè)二步發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要的作用。如何解析兩菌相互作用關(guān)系，找到關(guān)鍵控制點，進而提高K.vulgare的生產(chǎn)效率，以及如何實現(xiàn)一步法發(fā)酵等問題的解決，不僅可以降低維生素C的生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)收益，而且對于復(fù)雜微生物混菌體系的研究有重要的提示意義。本文對K.vulgare-Bacillus兩菌發(fā)酵過程進行了蛋白組分析，從蛋白質(zhì)水平探

2、究兩菌之間的相互作用模式；構(gòu)建了Gluconobacter oxydans-K.vulgare-B.endophyticus的三菌一步發(fā)酵體系，并對此三菌發(fā)酵過程進行了代謝物組、蛋白組分析，在兩菌關(guān)系研究的基礎(chǔ)上解析三菌作用模式。
　　采用iTRAQ標記定量蛋白組學手段，研究谷胱甘肽對K.vulgare作用前后的蛋白質(zhì)表達變化，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽可以促進維生素B1（硫胺素）的轉(zhuǎn)運，提高TCA循環(huán)、磷酸戊糖途徑的代謝，進而產(chǎn)生更多的ATP

3、與還原力NADPH，使得細胞整體抵抗活性氧刺激、能量代謝的能力得到增強，從而，K.vulgare的生長與產(chǎn)酸得到增強。采用基于二維凝膠電泳分離的蛋白組學手段，對維生素C工業(yè)第二步發(fā)酵生產(chǎn)過程進行了時間序列蛋白組研究。發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌產(chǎn)孢裂解可以促進K.vulgare中抵抗活性氧刺激的蛋白、PPP途徑蛋白、山梨糖轉(zhuǎn)化蛋白、以及細胞分裂蛋白FtsZ等的表達，結(jié)合代謝物檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的產(chǎn)孢裂解可以為K.vulgare提供嘌呤類物質(zhì)合成嘌呤

4、核苷酸，彌補K.vulgare中嘌呤合成的缺陷。對B.cereus-K.vulgare混菌實驗室連續(xù)傳代過程進行了蛋白組分析，發(fā)現(xiàn)二者在150天的連續(xù)傳代的進化過程中，各自獲得了更強的生長能力。
　　構(gòu)建了G.oxydans-K.vulgare-B.endophyticus三菌一步發(fā)酵體系，發(fā)酵周期穩(wěn)定在30 h左右，轉(zhuǎn)化率達到80％左右，可望達到與現(xiàn)有二步發(fā)酵相近的經(jīng)濟效益。通過對三菌體系進行代謝組、蛋白組分析，發(fā)現(xiàn)三菌的混合培

5、養(yǎng)促進了K.vulgare中的PPP途徑，以及負責山梨糖轉(zhuǎn)化的山梨糖/山梨酮脫氫酶SSDH的表達；G.oxydans利用山梨糖進行生長的能力減弱，即對中間產(chǎn)物的旁路消耗減少；在發(fā)酵中后期，B.endophyticus中碳代謝途徑EMP、TCA、PPP減弱，同時，芽孢的產(chǎn)生過程逐漸增強，不斷為K.vulgare提供嘌呤等物質(zhì)。通過三菌的相互配合，減少了中間產(chǎn)物山梨糖的旁路消耗，提高了K.vulgare的轉(zhuǎn)化能力，使得D-山梨醇向2-ket