基于膠原-Matrigel支架材料的工程化心肌組織構(gòu)建及體內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、缺血性心臟疾病是威脅人類健康的頭號(hào)殺手之一。心肌梗死伴隨著功能性心肌細(xì)胞大量死亡，最終導(dǎo)致心力衰竭。針對(duì)心衰晚期患者，心臟移植手術(shù)是目前臨床治療的唯一選擇。但因存在供體器官短缺、免疫排斥反應(yīng)及一系列移植后并發(fā)癥等問題，而無法在臨床廣泛應(yīng)用，急需尋找新的有效治療方法和手段。組織工程這門交叉學(xué)科的興起，為根治心臟疾病帶來了希望。
　　 近年來，心肌組織工程研究進(jìn)展迅速。國內(nèi)外相繼以新生大鼠心肌細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ESC)源

2、心肌細(xì)胞為種子細(xì)胞，在體外成功再造了工程化心肌組織，再造心肌組織具有節(jié)律性收縮特性，并在組織結(jié)構(gòu)方面與正常新生在體心肌組織相類似。盡管如此，目前心肌組織工程仍面臨種子細(xì)胞來源選擇、如何優(yōu)化心肌細(xì)胞-支架材料體外培育環(huán)境，以及如何提高再造心肌組織的質(zhì)量等一系列關(guān)鍵問題。
　　 從國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，Zimmermann等利用膠原/Matrigel為支架體外構(gòu)建心肌這一實(shí)驗(yàn)體系最為成功。但是該體系作為心肌體外再造模型采用的是動(dòng)態(tài)力學(xué)

3、拉伸，作為體外心肌再造研究模型的穩(wěn)定性和可靠性尚有待提高。此外，隨著相關(guān)研究的不斷深入，研究人員對(duì)如何實(shí)現(xiàn)工程化組織體外血管化、以及針對(duì)再造心肌組織中非心肌細(xì)胞成分對(duì)再造心肌組織質(zhì)量和心肌細(xì)胞體外三維重構(gòu)的影響給予了越來越多的關(guān)注。與此同時(shí)，本室以往利用該實(shí)驗(yàn)體系，以ESC源心肌細(xì)胞為種子細(xì)胞，雖然成功在體外制備了心肌組織，但因獲得種子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)長而影響了再造心肌效率與質(zhì)量。
　　 針對(duì)以上分析，本研究利用膠原/Ma

4、trigel實(shí)驗(yàn)體系，開展了基于靜態(tài)力學(xué)拉伸模型下的心肌組織體外再造研究，并通過添加血管內(nèi)皮細(xì)胞的方式，研究了血管內(nèi)皮細(xì)胞提高再造心肌組織的質(zhì)量的能力;與此同時(shí)，利用膠原/Matrigel實(shí)驗(yàn)體系，進(jìn)行了ESC分化發(fā)育的研究，重點(diǎn)觀察了ESC自發(fā)分化發(fā)育及向心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化情況，在此基礎(chǔ)上，利用已探索的定向誘導(dǎo)分化條件，研究ESC在本實(shí)驗(yàn)體系下進(jìn)一步分化形成心肌組織的能力，并對(duì)其動(dòng)物心梗修復(fù)能力進(jìn)行研究。
　　 本論文的主要

5、研究內(nèi)容與結(jié)果簡要概括如下，共分為以下四個(gè)部分：
　　 第一部分：基于靜態(tài)力學(xué)拉伸模型下的心肌組織體外再造研究
　　 再造心肌組織的質(zhì)量與微環(huán)境和非心肌細(xì)胞的作用關(guān)系密切。其中力學(xué)微環(huán)境對(duì)于再造心肌組織的質(zhì)量至關(guān)重要。目前國內(nèi)外常見的體外力學(xué)拉伸條件以動(dòng)態(tài)力學(xué)拉伸為主，該力學(xué)拉伸條件存在一定的局限性。相比之下，再造心肌作為心肌體外發(fā)育研究模型，靜態(tài)力學(xué)拉伸具有明顯的優(yōu)勢，其穩(wěn)定性和可靠性均較高。此外，近年來發(fā)育生物學(xué)研究

6、表明，心肌中非心肌細(xì)胞成分對(duì)心肌細(xì)胞三維重構(gòu)與心臟功能的發(fā)揮均起著重要作用，尤其是針對(duì)Telocytes細(xì)胞在心臟發(fā)育中作用的研究，是目前研究的熱點(diǎn)之一。
　　 在本部分研究中，首先建立了基于膠原/Matrigel三維立體靜態(tài)力學(xué)拉伸體系；其次，利用該體系，以新生大鼠心肌細(xì)胞為種子細(xì)胞，成功在體外構(gòu)建了工程化心肌組織片層。在此基礎(chǔ)上，通過組織學(xué)染色及免疫組織化學(xué)染色，對(duì)體外再造心肌組織中是否存在Telocytes細(xì)胞進(jìn)行檢測，并

7、對(duì)其在心肌細(xì)胞三維重構(gòu)與心臟功能發(fā)揮中的作用進(jìn)行探討。研究結(jié)果分別簡要介紹如下。
　　 在基于膠原/Matrigel三維立體靜態(tài)力學(xué)拉伸體系建立方面：研究結(jié)果表明，靜態(tài)力學(xué)拉伸抵抗了膠原凝膠在細(xì)胞存在時(shí)的強(qiáng)烈收縮，避免了由于過度收縮而引起的組織變厚，防止了材料中央部位細(xì)胞的大量死亡。在實(shí)施靜態(tài)力學(xué)拉伸后，再造心肌組織在體外始終維持一定的形狀和厚度，形成較均一的組織片層。
　　 在工程化心肌組織片層制備方面：研究結(jié)果表明，

8、心肌細(xì)胞在膠原/Matrigel三維立體靜態(tài)力學(xué)拉伸體系中，排列形成致密的肌纖維束，沿著靜態(tài)拉伸力的方向充分伸展。激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，可見心肌細(xì)胞相互連接部位部分區(qū)域存在Connexin43陽性染色，說明心肌細(xì)胞之間形成功能合胞體。此外，透射電鏡結(jié)果表明工程化心肌組織中，心肌細(xì)胞肌小節(jié)排列具有方向性，并且可以觀察到與細(xì)胞機(jī)械收縮和電信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)的超微結(jié)構(gòu)，如縫隙連接、橋粒等。
　　 在工程化心肌組織中是否存在Telocyte

9、s細(xì)胞方面：組織學(xué)染色可以觀察到再造心肌組織中存在一種長梭形細(xì)胞，具有兩個(gè)或三個(gè)長細(xì)胞突起，形態(tài)上與Telocytes細(xì)胞相似。此外，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，這類長梭形細(xì)胞表達(dá)SMA陽性、Vimentin陽性和CD117陽性。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們初步判定在工程化心肌組織中可能存在Telocytes細(xì)胞。
　　 第二部分：組織工程化心肌體外血管化研究
　　 再造組織血管化研究一直是組織工程包括心肌組織工程研究關(guān)注的焦點(diǎn)

10、。近年來國內(nèi)外研究報(bào)道表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞在三維支架材料中可形成血管樣結(jié)構(gòu)，并且血管內(nèi)皮細(xì)胞還對(duì)心肌細(xì)胞體外空間重構(gòu)、存活和提高再造心肌組織的質(zhì)量發(fā)揮重要作用。本部分研究，在前期建立基于膠原/Matrigel支架材料構(gòu)建工程化心肌組織的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在凝膠體系中將血管內(nèi)皮細(xì)胞與心肌細(xì)胞復(fù)合，深入研究了血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)心肌組織血管化能力和提高心肌組織質(zhì)量的促進(jìn)作用。
　　 研究結(jié)果表明，復(fù)合了血管內(nèi)皮細(xì)胞的組織工程化心肌中，血管樣結(jié)構(gòu)

11、形成明顯增加，可見較多vWAg陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞排列形成條索樣結(jié)構(gòu)。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞還對(duì)心肌細(xì)胞空間排布上產(chǎn)生影響，cTnT和vWAg熒光雙標(biāo)記激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞在空間上相互靠近，心肌細(xì)胞更偏向于在血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)中存在。此外，加入血管內(nèi)皮細(xì)胞還可以穩(wěn)定再造心肌組織結(jié)構(gòu)，提高再造心肌組織的收縮能力。
　　 第三部分：ESC在膠原/Matrigel支架材料中分化發(fā)育的實(shí)驗(yàn)研究
　　 在ESC分化發(fā)育

12、研究中，擬胚體(EBs)的形成對(duì)于ESC分化發(fā)育發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)有ESC分化發(fā)育研究體系多是將ESC形成EBs與EBs進(jìn)一步分化發(fā)育這一連續(xù)過程分割為兩個(gè)階段：首先是在二維或三維環(huán)境中形成EBs，隨后將所形成的EBs二維貼壁誘導(dǎo)分化或接種在三維支架材料中進(jìn)一步誘導(dǎo)分化。
　　 在本研究中，基于膠原/Matrigel這一實(shí)驗(yàn)體系在心肌再造方面取得的良好結(jié)果和建立的平臺(tái)條件，將ESC以單細(xì)胞形式直接接種在膠原/Matrigel支架

13、材料中，進(jìn)而觀察EBs形成以及后續(xù)分化發(fā)育情況，從而探討膠原/Matrigel對(duì)ESC在三維立體環(huán)境中直接形成EBs的可行性。重點(diǎn)針對(duì)ESC接種密度對(duì)EBs形成的影響、不同支架材料組成對(duì)EBs形成與分化的影響以及ESC在本體系下自發(fā)分化情況進(jìn)行了研究。
　　 其中，在ESC接種密度對(duì)EBs形成影響的研究方面，結(jié)果表明ESC在膠原/Matrigel支架材料中可以直接啟動(dòng)EBs形成，并且ESC接種濃度對(duì)EBs形成具有明顯影響，其最佳

14、接種密度在105個(gè)/ml至106個(gè)/mL之間。在這一密度范圍內(nèi)，ESC所形成的EBs數(shù)量多、體積大。在不同支架材料組成對(duì)EBs形成與分化的影響研究方面，將ESC分別在單純膠原凝膠及膠原/Matrigel不同體系中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，支架材料中的膠原凝膠成分主要影響EBs形成，而Matrigel成分則對(duì)EBs分化發(fā)育與發(fā)揮重要作用。在ESC自發(fā)分化研究方面，將ESC在膠原/Matrigel三維立體環(huán)境中培養(yǎng)，在不施加任何誘導(dǎo)條件的情況下，通過組織學(xué)

15、染色結(jié)果表明，體外培養(yǎng)21d后EBs自發(fā)分化形成了與在體結(jié)構(gòu)類似的各種組織結(jié)構(gòu)，如有心肌細(xì)胞合胞體樣結(jié)構(gòu)、管腔樣結(jié)構(gòu)形成。針對(duì)CK18、CD31、cTnT、Nestin等免疫組織化學(xué)染色結(jié)果證實(shí)，ESC可以分化為cTnT陽性的心肌細(xì)胞、CK18陽性的上皮細(xì)胞、CD31陽性的內(nèi)皮細(xì)胞以及Nestin陽性細(xì)胞等。
　　 第四部分：基于ESC為種子細(xì)胞的心肌組織構(gòu)建及體內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究
　　 在本部分研究中，利用我室在心肌組織

16、工程研究方面既有的研究平臺(tái)和技術(shù)體系，在前期利用膠原/Matrigel進(jìn)行ESC定向體外分化研究的基礎(chǔ)上，探索了ESC進(jìn)一步定向誘導(dǎo)分化并形成心肌組織的能力及其動(dòng)物心梗修復(fù)能力。
　　 ESC在本體系下是否可以通過特定誘導(dǎo)條件而向心肌細(xì)胞分化進(jìn)而形成心肌組織是本論文研究關(guān)注的焦點(diǎn)之一。在本部分研究中，通過添加抗壞血酸作為ESC向心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑，進(jìn)行了ESC體外定向誘導(dǎo)分化及心肌組織三維再造研究，并對(duì)再造組織進(jìn)行了組織學(xué)及免

17、疫組織化學(xué)鑒定。在此基礎(chǔ)上，將所構(gòu)建的工程化心肌組織移植到心梗部位，觀察其在心梗部位存活、分化，及對(duì)心功能的改善情況。
　　 研究發(fā)現(xiàn)ESC在膠原/Matrigel支架材料中培養(yǎng)10-11d時(shí)(誘導(dǎo)3-4d)分化形成大量跳動(dòng)的細(xì)胞，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，跳動(dòng)細(xì)胞的數(shù)量和面積逐漸增多，14d(誘導(dǎo)7d)左右可見形成大面積跳動(dòng)區(qū)域，體外培養(yǎng)19d(誘導(dǎo)12d)左右出現(xiàn)一致性跳動(dòng)區(qū)域。對(duì)其進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色證實(shí)，再造心肌組織中含有

18、大量表達(dá)cTnT、Nkx2.5和GATA4陽性的心肌細(xì)胞。與向心肌細(xì)胞自發(fā)分化相比，誘導(dǎo)分化后cTnT陽性細(xì)胞的大量增多，提示抗壞血酸顯著促進(jìn)了ESC向心肌細(xì)胞分化。并且，隨著再造心肌組織中心肌細(xì)胞逐漸成熟，可見心肌細(xì)胞相互連接部位部分區(qū)域存在Connexin43陽性染色。免疫組織化學(xué)染色同時(shí)還揭示了在再造心肌組織中存在ESC分化來源的Nestin陽性細(xì)胞和CD31陽性細(xì)胞。
　　 將上述體外再造心肌組織進(jìn)行心梗部位移植，并將單

19、純心梗組和非收縮片層移植組作為對(duì)照組。移植術(shù)后4w進(jìn)行心功能檢測，結(jié)果表明，與單純心梗組和非收縮片層移植組相比，工程化心肌組織移植組可以顯著改善梗死心肌的收縮及舒張功能。組織切片染色觀察顯示工程化心肌組織片層緊密貼附于梗死心肌部位，并已在結(jié)構(gòu)上與宿主心肌發(fā)生整合，兩者之間界限不明顯。此外，針對(duì)心肌特異性標(biāo)志cTnT，Nkx2.5，GATA4，connexin43免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，再造工程化心肌組織中存在具有分化心肌細(xì)胞表型的細(xì)胞

20、，并且Connexin43染色結(jié)果表明工程化心肌組織及工程化心肌組織與宿主心肌細(xì)胞之間形成了較廣泛的細(xì)胞間連接。CD31染色結(jié)果顯示在移植的工程化心肌組織中存在較豐富的血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且形成了管腔樣結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)工程化心肌組織移植后畸胎瘤形成情況進(jìn)行了檢測。移植4w后，開胸觀察畸胎瘤形成。工程化心肌組織移植組移植后會(huì)引起畸胎瘤發(fā)生，發(fā)生率在25％(3+/12)，形成的畸胎瘤位于心肌梗死部位，具有一定肉眼可見的體積，而在動(dòng)物胸腔和腹

21、腔均未檢測到畸胎瘤形成。所形成的畸胎瘤包含典型的三胚層結(jié)構(gòu)。
　　 綜上所述，本論文以膠原/Matrigel為支架材料，在體外建立了三維立體靜態(tài)力學(xué)拉伸體系，并利用該體系，以新生大鼠心肌細(xì)胞為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建了工程化心肌組織片層，并對(duì)再造心肌組織中是否存在Telocytes細(xì)胞進(jìn)行研究。此外，通過將血管內(nèi)皮細(xì)胞與心肌細(xì)胞復(fù)合在膠原/Matrigel支架材料中，進(jìn)一步研究了再造心肌組織血管化能力。在此基礎(chǔ)上，基于靜態(tài)力學(xué)拉伸體系