粘細(xì)菌Stigmatella WXNXJ-B產(chǎn)生新型抗腫瘤抗生素的研究.pdf

1、粘細(xì)菌是一類具有群體習(xí)性和復(fù)雜發(fā)育史的、革蘭氏陰性單細(xì)胞的滑行細(xì)菌的總稱。粘細(xì)菌能產(chǎn)生很多具有生物活性的化合物,這些化合物具有結(jié)構(gòu)新、種類多、作用機(jī)制多樣等特點(diǎn),為新藥的篩選提供了很好的微生物資源,因此關(guān)于粘細(xì)菌生物活性物質(zhì)的研究工作日趨受到重視。本文對本實(shí)驗(yàn)室保存的WXNXJ-B菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定并分類;檢測其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì),并對其生長條件進(jìn)行了優(yōu)化;以小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞為模型,對其產(chǎn)生的高活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化和鑒定

2、;并以其為主要目標(biāo),對WXNXJ-B菌株搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化;分析WXNXJ-B產(chǎn)生的活性物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的毒性以及探索體外對腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)理。
　　 對WXNXJ-B菌落形態(tài)和生理生化特征進(jìn)行觀察,把所得到的結(jié)果與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)比較,鑒定此菌為標(biāo)樁菌屬(Stigmatella sp.);采用SPME/GC/MS方法對菌體產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定,WXNXJ-B菌主要產(chǎn)生酮類和雜環(huán)類化合物;以菌體生

3、物量為目標(biāo),采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了菌株的生長條件,最佳生長條件和培養(yǎng)基為:麥芽糖8 g/L,酵母粉6 g/L,胰蛋白胨6 g/L,D-葡萄糖酸鈉5 g/L,CaCl21.5 g/L,MgSO40.5 g/L,初始pH為7.0,培養(yǎng)溫度為28℃。
　　 采用MTT法評價(jià)活性代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒性和對外界環(huán)境的穩(wěn)定性。結(jié)果表明Stigmatella WXNXJ-B所產(chǎn)生的活性物質(zhì)對B16細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞HepG2和人乳腺癌細(xì)胞DMA

4、-MB231有很高的活性,在不高于70℃的條件下活性物質(zhì)穩(wěn)定,對自然光和紫外光不敏感,在pH3-10時(shí)較穩(wěn)定。對代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性分析發(fā)現(xiàn)樹脂提取液中主要含有甙類、甾體類、生物堿類和內(nèi)酯類物質(zhì)。
　　 以B16腫瘤細(xì)胞系為模型,采用液液萃取、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱、低壓C18柱和HPLC分離、純化和制備等手段分離純化出一高活性物質(zhì),通過對其NMR、LC/MS、MALDI-TOF MS/MS、IR和UV等圖譜的解析

5、,確定其分子量為435 Da,化學(xué)式為C29H25NO3以及結(jié)構(gòu)式為:
　　 根據(jù)習(xí)慣命名法、系統(tǒng)命名法,并參考國際慣例,給出了化合物C29H25NO3的俗名(Quinoxalone,喹樂霉素)和系統(tǒng)名稱([1R,6R]-5-(6-benzyl-quinolin-3-ylmethyl)-6-phenyl-3,7-dioxa-bicyclo[4.1.0]heptan-3-One,5-(6-苯甲基-喹啉-3-基甲基-6-苯基-3-7

6、-二氧-雙環(huán)[4.1.0]庚烷-3-酮)。通過教育部科技查新文獻(xiàn)檢索中心華東理工大學(xué)站對喹樂霉素的名稱、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及研究現(xiàn)狀進(jìn)行了查新工作(查新號為201036000L060001),未發(fā)現(xiàn)具有相同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)被報(bào)道。
　　 對Stigmatella WXNXJ-B產(chǎn)喹樂霉素的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的最佳條件為培養(yǎng)時(shí)間6天,接種量8％,溫度28℃,裝液量80 mL/500 mL,pH為6.5;考察了無機(jī)離子、銨鹽與磷酸鹽、前體

7、物質(zhì)、氨基酸對喹樂霉素發(fā)酵的影響,結(jié)果表明Ca2+、Mg2+、Zn2+、Co2+和Na+有促進(jìn)作用,Li2+有抑制作用,銨鹽不高于2 g/L具有促進(jìn)作用;磷酸鹽不起作用;0.4 g/L乙酸鈉和0.8 g/L丙酸鈉分別可以提高至905.15μg/L和878.42μg/L;適量的乙醇、乳酸、異丙醇、異戊醇、色氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸和谷氨酸有促進(jìn)作用;纈氨酸對喹樂霉素的合成有抑制作用。
　　 采用Plackett-Burman設(shè)

8、計(jì)法篩選出培養(yǎng)基中脫脂奶粉、MgSO4·7H2O和葡萄糖對喹樂霉素的產(chǎn)量影響較大;采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化出三個(gè)影響因子水平:葡萄糖5.12 g/L,MgSO4·7H2O0.8 g/L和脫脂奶粉7.92 g/L,在這個(gè)條件下喹樂霉素的產(chǎn)量可達(dá)到1205.08μg/L,比優(yōu)化前提高了59.69％。同時(shí)通過對大孔樹脂的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn),篩選出對喹樂霉素吸附效果較好的D101樹脂。
　　 體外毒性實(shí)驗(yàn)表明,喹樂霉素對B16、

9、HepG2、CT-26和DMA-MB231腫瘤細(xì)胞系都有很強(qiáng)細(xì)胞毒性,對這四種腫瘤細(xì)胞的IC50分別為2.41、5.4、2.83、1.78μg/mL。與對照Taxol和Epothilone B相比,其毒性與Taxol相近;喹樂霉素對正常小鼠的脾臟細(xì)胞的毒性較低(IC50＞700μg/mL)。因此,喹樂霉素是選擇性地作用于細(xì)胞。
　　 B16細(xì)胞被不同濃度的喹樂霉素處理24 h后于倒置顯微鏡下,可見B16細(xì)胞數(shù)量減少,形態(tài)變圓:掃

10、描電鏡觀察到B16細(xì)胞表明大量微絨毛消失,并可見細(xì)胞表面出泡以及凋亡小體的形成;熒光電鏡下B16細(xì)胞核皺縮,細(xì)胞核熒光呈顆粒狀或片絮狀,可見致密強(qiáng)熒光。DNA Ladder電泳結(jié)果顯示B16細(xì)胞的DNA呈梯度,含有180-200 bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段。采用流式細(xì)胞儀檢測碘化丙啶單染色的B16細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),喹樂霉素主要將腫瘤細(xì)胞阻滯在S期和G2/M期,阻止細(xì)胞分裂和進(jìn)入細(xì)胞增殖周期,導(dǎo)致B16腫瘤細(xì)胞凋亡。B16細(xì)胞經(jīng)過碘化丙啶和羅丹