TRPV1在胃食管反流豚鼠模型氣道神經(jīng)源性炎癥中作用的研究.pdf

1、前言:
　　 胃食管反流(gestroesophageal reflux，GER)相關(guān)性呼吸系統(tǒng)病變一直是呼吸領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)之一。許多臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)GER與慢性咳嗽、支氣管哮喘、肺纖維化以及慢性阻塞性肺疾病等呼吸系統(tǒng)病變具有相關(guān)性。其中胃食管反流性咳嗽為慢性咳嗽的常見病因之一，其發(fā)生機(jī)制未完全明確，多認(rèn)為與胃食管反流引起氣道炎癥及咳嗽敏感性增加有關(guān)。而引起氣道炎癥的機(jī)制主要認(rèn)為與微量或大量誤吸胃內(nèi)容物（酸性和非酸性物質(zhì)）直

2、接或間接刺激氣道引起氣道炎癥、感覺神經(jīng)（主要為無(wú)髓C神經(jīng)纖維）參與的食管-支氣管神經(jīng)反射及氣道感覺神經(jīng)肽釋放所致的神經(jīng)源性炎癥等因素有關(guān)。上述機(jī)制均有感覺神經(jīng)C纖維參與，當(dāng)食管或氣道內(nèi)出現(xiàn)酸性物質(zhì)時(shí)，刺激分布在食道及氣道內(nèi)C神經(jīng)纖維末梢的傷害性感受器，引起C神經(jīng)纖維沖動(dòng)增加，通過軸突反射釋放神經(jīng)肽引起神經(jīng)源性炎癥。同時(shí)，沖動(dòng)傳至中樞，與孤束核及相應(yīng)節(jié)段脊髓的神經(jīng)元形成突觸，引起呼吸反射。瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1(Transient r

3、eceptor potential vanilloid1，TRPV1)為離子通道蛋白，分布于C神經(jīng)纖維末梢，為其主要的離子通道蛋白之一。TRPV1通道蛋白在酸等化學(xué)性刺激后開放，引起陽(yáng)離子（主要為鈣離子）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致神經(jīng)纖維沖動(dòng)增加，引起神經(jīng)元胞體內(nèi)感覺神經(jīng)肽合成和分泌增加。這些感覺神經(jīng)肽包括:降鈣素基因相關(guān)肽、P物質(zhì)(P substance，SP)、神經(jīng)肽A、神經(jīng)肽B等。感覺神經(jīng)興奮后，這些感覺神經(jīng)肽釋放到肺及氣道，引起神經(jīng)源性炎

4、癥，主要表現(xiàn)為血管擴(kuò)張，微血管滲漏，氣管及支氣管的收縮，上皮杯狀細(xì)胞和粘膜下腺體粘液分泌增加，增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)傳遞等。理論上講，如能抑制TRPV1受體，會(huì)減輕胃食管反流所致的氣道炎癥。本課題組已證實(shí)SP參與了胃食管反流性氣道高反應(yīng)的發(fā)病過程，食管灌注鹽酸GER豚鼠模型的C7-T5脊神經(jīng)節(jié)和相應(yīng)節(jié)段脊髓背角內(nèi)的SP表達(dá)增加，但TRPV1活性改變能否影響GER模型氣道及肺組織SP的表達(dá)并進(jìn)而影響氣道炎癥程度目前尚不清楚，故本研究以多次鹽酸灌注

5、豚鼠食管GER動(dòng)物模型為研究對(duì)象，觀察該動(dòng)物模型氣道及感覺神經(jīng)內(nèi)臟傳入部位TRPV1表達(dá)情況、改變TRPV1活性是否能影響胃食管反流動(dòng)物模型氣道炎癥程度以及是否可以影響肺部神經(jīng)肽SP及促炎因子IL-8表達(dá)，試圖為臨床應(yīng)用TRPV1拮抗劑治療胃食管反流性咳嗽等GER相關(guān)性呼吸系統(tǒng)病變提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1、多次鹽酸灌注豚鼠食管胃食管反流動(dòng)物模型建立
　　 白化豚鼠（普通級(jí)雄性）40只，體重35

6、0g±50g，隨機(jī)分為4組:PBS對(duì)照組（對(duì)照組）;HCL模型組（模型組）;HCL+Capsaicin組(CAP組);HCL+Capsazepine組(CPZ組)。模型組食管鹽酸灌注方法:腹腔注射鹽酸氯胺酮(50mg/kg)輕度麻醉豚鼠，仰臥位固定于鼠臺(tái)上，經(jīng)口將5F胃管插入豚鼠食管的中、下段(插入深度約11-13cm)，以26ml/h速度緩慢灌注0.1 mol/L HC1溶液（含0.5％胃蛋白酶），每天1次，每次20min，連續(xù)14d

7、。對(duì)照組:用PBS代替鹽酸灌注食管，方法同上。HCL+CAP組在每次灌酸前30分鐘按5mg/kg腹腔注射Capsaicin（辣椒素，TRPV1受體激動(dòng)劑）。HCL+CPZ組在每次灌酸前30分鐘按1μmol/kg腹腔注射Capsazepine（辣椒平，TRPV1受體抑制劑）。對(duì)照組和模型組在每次灌酸前30分鐘按1ml/kg腹腔注射溶媒（含10％乙醇和10％吐溫80的生理鹽水溶液）。
　　 2、豚鼠肺功能測(cè)定
　　 末次灌注

8、24h后，各組豚鼠進(jìn)行肺功能測(cè)定，清醒非限制活動(dòng)狀態(tài)下的豚鼠置于小動(dòng)物肺功能檢測(cè)分析儀（Emka公司，法國(guó)）的整體體描箱內(nèi)，檢測(cè)豚鼠在霧化吸入倍增濃度乙酰甲膽堿(基礎(chǔ)值、0、25、50、100、200、400、800mg/l)后肺功能參數(shù)吸氣時(shí)間(Ti)、呼氣時(shí)間(Te)、吸氣峰值流速(PIF)、呼氣峰值流速(PEF)、潮氣量(TV)、呼吸頻率(F)及分鐘通氣量(MV)的變化。
　　 3、支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù)及分

9、類
　　 測(cè)定豚鼠肺功能后，戊巴比妥（按80mg/kg）腹腔注射麻醉豚鼠，仰臥位固定，分離氣管，開胸結(jié)扎右主支氣管，經(jīng)氣管插管行左肺灌洗無(wú)菌PBS，收集BALF并離心、涂片及HE染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類。
　　 4、HE染色觀察食管，氣管和肺組織病理變化
　　 各組豚鼠4％多聚甲醛經(jīng)左心室全身灌流固定后，取氣管、肺及食管制作石蠟切片，HE染色，同一有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師光鏡下對(duì)比觀察各組織炎癥改變情況。
　　

10、5、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TRPV1、SP的表達(dá)
　　 取各組的氣管、肺組織、C7-T5段脊髓和相應(yīng)節(jié)段脊神經(jīng)節(jié)石蠟切片，參照SABC法免疫組織化學(xué)試劑盒步驟檢測(cè)氣管、C7-T5段脊髓和相應(yīng)節(jié)段脊神經(jīng)節(jié)及肺組織TRPV1表達(dá)及肺組織中SP的表達(dá)情況。
　　 6、免疫印跡檢測(cè)氣管、肺組織及C7-T5段脊髓中TRPV1表達(dá)。
　　 氣管、肺組織及C7-T5段脊髓中蛋白提取和定量后，取等量樣品進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，經(jīng)一抗和

11、二抗孵育后顯色，圖像分析。
　　 7、ELISA方法檢測(cè)各組豚鼠BALF中SP及IL-8表達(dá)情況。
　　 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有原始數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，四組間比較采用單因素方差分析，正態(tài)分布并方差齊時(shí)，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn);方差不齊時(shí)應(yīng)用Tamhane' sT2檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用軼和檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　

12、　 1、四組豚鼠食管、支氣管和肺組織病理檢測(cè)
　　 正常對(duì)照組豚鼠食管結(jié)構(gòu)基本正常;模型組食管可見輕度炎癥改變，如:上皮層輕度增厚，上皮過度角化，同時(shí)乳頭延長(zhǎng)，基底層及棘層細(xì)胞增生，固有層可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜下層內(nèi)血管擴(kuò)張，充血。對(duì)照組氣管、支氣管、肺組織HE染色未見明顯異常改變;但模型組可見明顯炎癥改變:氣管可見部分上皮結(jié)構(gòu)紊亂，部分脫落，在粘膜和粘膜下層，可見血管充血、擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和少許嗜酸性粒細(xì)

13、胞浸潤(rùn)，肺組織、細(xì)支氣管管壁及管腔內(nèi)可見中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及少許嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)支氣管管壁略增厚，管腔狹窄，部分可見粘液栓。CAP組上述改變較模型組加重，而CPZ組上述組織炎癥改變減輕。
　　 2、四組豚鼠肺功能測(cè)定
　　 四組豚鼠肺功能參數(shù)基礎(chǔ)值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隨Mch濃度的遞增，四組豚鼠均逐漸出現(xiàn)呼吸費(fèi)力，輔助呼吸肌（腹?。﹨⑴c呼吸運(yùn)動(dòng)，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)張口呼吸，耳及吻部皮膚發(fā)紺，甚至出現(xiàn)意識(shí)改變，呼吸波形圖提示呼吸頻

14、率輕度增快后明顯減慢、但PEF及PIF較基礎(chǔ)值明顯增加等表現(xiàn)。模型組和CAP組豚鼠接受200mg/(l)Mch霧化吸入激發(fā)后出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸困難，無(wú)法接受下一劑量藥物刺激;CPZ組豚鼠接受400mg/(l)Mch霧化吸入激發(fā)后出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸困難，無(wú)法接受下一劑量藥物刺激;對(duì)照組豚鼠完成全部劑量Mch的激發(fā)刺激。在劑量為100mg/(l)起，四組豚鼠吸氣時(shí)間、呼氣時(shí)間、呼吸頻率、潮氣量、吸氣峰流速、呼氣峰流速、分鐘通氣量差異明顯增大，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、意義。
　　 3、各組BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類比較
　　 與對(duì)照組比較，模型組BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)百分比明顯增加（P＜0.01），CAP組中性粒細(xì)胞比例較模型組有所升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CPZ組較模型組明顯下降（P＜0.01）。模型組、CAP組CPZ組豚鼠BALF中嗜酸細(xì)胞所占比例略高于對(duì)照組，但四組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、免疫組織化學(xué)染色及分析
　　 四組氣管、

16、肺組織、C7-T5段脊神經(jīng)節(jié)和相應(yīng)節(jié)段脊髓背角中均有TRPV1的表達(dá)，但強(qiáng)弱不同，模型組表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），CAP組較模型表達(dá)增加，而CPZ組各組織中TRPV1表達(dá)較模型組下降(P＜0.01)。模型組下呼吸道SP表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，CAP組強(qiáng)于模型組，而CPZ組較模型組表達(dá)明顯減少(P＜0.01)。
　　 5、免疫印跡檢測(cè)TRPV1的表達(dá)
　　 四組組氣管、肺組織、C7-T5段脊髓中均有TRPV1的表

17、達(dá)，模型組表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），而CPZ組表達(dá)較模型組下降(P＜0.01)，CAP組較模型組TRPV1在氣管肺組織及脊髓中表達(dá)增加。
　　 6、各組BALF中SP及IL-8含量比較
　　 ELISA方法檢測(cè)BALF中SP及IL-8結(jié)果提示:模型組SP及IL-8含量明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），而CAP組SP含量較模型組增高（P＜0.01），CAP組BALF中IL-8雖高于模型組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CP

18、Z組SP及IL-8含量較模型組均降低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、多次鹽酸灌注食管可引起豚鼠氣道及肺組織明顯神經(jīng)源性炎癥改變，引起豚鼠對(duì)Mch刺激反應(yīng)敏感性增強(qiáng)，可能為胃食管反流相關(guān)性咳嗽的發(fā)病基礎(chǔ)。
　　 2、TRPV1在胃食管反流性相關(guān)性氣道炎癥發(fā)生中起著重要作用，抑制TRPV1活性可以減輕GER豚鼠模型氣道及肺組織炎癥程度，改善其肺功能。
　　 3、通過影響氣道及肺內(nèi)SP的表達(dá)可能為T