三種增塑劑(DEHP、DBP和TBAC)對牙鲆鰓細胞FG和斑馬魚胚胎的毒性作用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、增塑劑(又稱塑化劑),是一類工業(yè)用高分子材料助劑,被廣泛添加到塑料制品中以提高塑料的柔韌性。因其在環(huán)境中的高遷移性,現(xiàn)已成為地球上最廣泛存在的污染物之一。2011年臺灣所爆發(fā)的“增塑劑風(fēng)波”,進一步激起了全社會對增塑劑毒性的廣泛關(guān)注。由于水生生物大都是體外產(chǎn)卵、體外受精和體外發(fā)育,而增塑劑的生殖毒性和發(fā)育毒性可能會嚴(yán)重影響水生生物種群的未來。目前有關(guān)增塑劑對水生生物毒性的研究報道還很少,也缺乏系統(tǒng)有效的針對增塑劑類污染物毒性特點的生物評

2、價技術(shù)和體系,這很不利于人們對增塑劑毒性的預(yù)防和管理工作。
  本文首先利用海水魚類牙鲆的鰓細胞系(FG)比較研究了3種增塑劑鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和乙酰檸檬酸三丁酯(TBAC)的急性細胞毒性效應(yīng),采用MTT法、中性紅(NR)吸收法、乳酸脫氫酶(LDH)釋放法、吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙熒光染色法和DNA ladder法,分別檢測了以上三種增塑劑對牙鲆鰓FG細胞的活性影響、生長抑制、細胞

3、膜損傷和細胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。
  從細胞形態(tài)上觀察,這三種增塑劑都會對FG產(chǎn)生細胞毒性,隨著處理濃度的升高和時間的延長,細胞皺縮變圓的數(shù)目也逐漸增多,說明這三種增塑劑的細胞毒性具有一定的濃度效應(yīng)和時間效應(yīng)。這三者的最低效應(yīng)濃度(LOEC)分別為:DEHP為150μg/mL,DBP為50μg/mL,TBAC為150μg/mL。
  MTT法分析結(jié)果表明,以上3種增塑劑對FG細胞的活性均有抑制作用,但濃度較低時(0.005~50μ

4、g/mL),抑制作用不明顯,并且這三者之間沒有明顯的毒性差異,其在24 h和48 h的細胞活性抑制率分別約為96%和94%。當(dāng)濃度達到150μg/mL時,才表現(xiàn)出明顯的抑制作用,其毒性等級為:DBP>TBAC>DEHP。DEHP、DBP和TBAC對FG細胞24 h的抑制率分別為:96±0.19%、80.8±3.7%和91.9±3.9%;48 h的抑制率分別為:94.8±1.5%、62.8±2.5%和73.8±0.58%。這表明,以上3種

5、增塑劑對FG細胞活性的抑制作用具有明顯的時間效應(yīng),隨著時間的延長,對FG細胞的抑制作用增強。
  中性紅(NR)吸收法分析結(jié)果表明,以上3種增塑劑都可以抑制 FG細胞的生長,而且這種抑制作用具有明顯的濃度依賴性和時間依賴性,且毒性等級為:DBP>TBAC>DEHP。在0.005μg/mL時,DEHP、DBP和TBAC對FG細胞24 h的抑制率分別為:96.7±0.79%,95.8±0.65%和95.9±1.1%;48 h的抑制率分

6、別為95.9±1.1%,93.3±0.8%和94.1±1.4%。DEHP、DBP和TBAC對FG細胞的24 h的IC50(半數(shù)抑制濃度)值分別為:290.4(242.0-348.6)、144.8(99.23-211.2)和217(176.3-267.2)μg/mL(95%的置信區(qū)間);48 h的IC50值分別為:213.8(166.6-274.3)、108.3(71.05-165.0)和135.8(97.54-189.1)μg/mL(9

7、5%的置信區(qū)間)??梢?,中性紅吸收法更適合檢測這三種增塑劑對 FG細胞的毒性作用。
  乳酸脫氫酶(LDH)釋放法分析結(jié)果表明,隨著三種增塑劑濃度的升高,處理組FG細胞中的培養(yǎng)基上清中乳酸脫氫酶含量也隨之升高,具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系,其毒性等級也為:DBP>TBAC>DEHP。0.005μg/mL的DEHP、DBP和TBAC處理FG細胞24 h后的LDH相對活性最低,分別為:21.1±5.8%、33.4±0.8%和30.2±0.8

8、%;而150μg/mL的DEHP、DBP和TBAC處理FG細胞24 h后的相對活性最高,分別為:48.4±0.5%、72.6±1.6%和52.2±5.7%。以上結(jié)果表明,3種增塑劑可破壞FG細胞的細胞膜,使細胞膜的完整性遭到破壞,致使FG細胞質(zhì)中的LDH被釋放到培養(yǎng)基上清中。
  AO/EB雙熒光染色結(jié)果表明,這三種增塑劑對 FG細胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)很低,最高濃度(150μg/mL)的DEHP、DBP和TBAC處理FG細胞24 h后

9、的凋亡誘導(dǎo)率分別為:2.4%、28%和6%。因此,沒有檢測到DNA ladder。
  其次,本文還利用斑馬魚胚胎,比較研究了以上3種增塑劑的胚胎毒性,對這3種增塑劑對胚胎各個發(fā)育階段產(chǎn)生的畸形特征、24 h的致死率和72 h的孵化率的檢測結(jié)果表明,(1)這三種增塑劑均能影響胚胎的發(fā)育,4 h時可觀察到胚胎自溶的現(xiàn)象,8 h時可觀察到外包變緩的現(xiàn)象,12 h時可觀察到無體節(jié)形成的現(xiàn)象,24 h時可觀察到無頭部形成的現(xiàn)象,48 h時

10、可觀察到色素沉積減少或缺失的現(xiàn)象,72 h時可觀察到孵化率降低,并且出現(xiàn)心包囊腫的現(xiàn)象,96 h時可觀察到脊柱彎曲的現(xiàn)象。(2)24 h的致死率研究結(jié)果表明:隨著增塑劑濃度的升高,胚胎致死率也逐漸升高。在最低濃度時(0.005μg/mL),DEHP、DBP和TBAC的胚胎致死率分別為:16.7±5.8%、76.7±7.6%和18.3±2.9%。DBP的毒性較高,在50和150μg/mL時,胚胎全部死亡。而DEHP和TBAC在150μg/

11、mL的致死率分別為65±5%和75±5%。(3)72 h的孵化率也隨著增塑劑濃度的升高,孵化率逐漸降低。DBP在最低濃度(0.005μg/mL)時,胚胎的孵化率已經(jīng)比較低,為16.7±8.2%;在50和150μg/mL時,孵化率為0。而DEHP和TBAC在150μg/mL的孵化率分別為21.7±12.6%和10±13.2%。
  最后,通過比較三種增塑劑之間的毒性差異,對不同增塑劑毒性作用的可能機制進行了分析和討論。TBAC對牙鲆

12、鰓細胞FG和斑馬魚胚胎都具有毒性,并且毒性高于DEHP,這一結(jié)果與已報道的有關(guān)TBAC無毒的實驗結(jié)果不一致。
  綜上所述,中性紅(NR)吸收法比MTT法更適合檢測這三種增塑劑對FG細胞生長的抑制作用,其檢測結(jié)果與乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測結(jié)果相一致;24 h的吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙熒光染色法檢測結(jié)果說明這三種增塑劑對FG細胞的致死可能不是通過凋亡誘導(dǎo)途徑;通過觀察這三種增塑劑對胚胎發(fā)育的影響,說明其對斑馬魚胚胎都具

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