利用BMP-膠原絲和BMSC-明膠微球構建大尺寸生物仿生骨組織.pdf

1、微構技術構建大尺寸組織在再生醫(yī)學領域（特別是骨組織工程方面）已被廣泛應用。我們則是利用由大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)、cultispher-s明膠微球構成的細胞單元和由骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bonemorphogenetic protein，BMP)和有序膠原絲構成的分化調控單元來構建厘米級的生物仿生骨組織。
　　細胞單元為BMSCs和cultispher-s明膠

2、微球在細胞培養(yǎng)轉瓶內培養(yǎng)7天后所獲得的長滿細胞的微組織。方法為BMSCs以5×104/ml的密度接種到上述細胞培養(yǎng)瓶內，培養(yǎng)基補至500ml;37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中間歇攪拌接種(off30min，on3min，30r/min)，8h后將磁力攪拌器調為50r/min連續(xù)攪拌，每2天全量換液1次，7天后收獲細胞單元。實驗證明骨髓間充質干細胞能夠很好地接種到cultispher-s膠原微球，并在微球上迅速擴增。
　　分化調控單元則是

3、由有序膠原絲和實驗室制備的與膠原具有特殊結合區(qū)域的BMP（簡稱CBD-BMP）構成。有序膠原絲具有很好的有序結構和生物相容性，且無體外致突變性。CBD-BMP是將膠原結合區(qū)(collagen-binding domain，CBD)融合入骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)，通過體外活性以及LOCS特異結合能力檢測，說明CBD結合區(qū)并不影響因子的活性，而且可以特異地與膠原結合，靶向錨定在LOCS上

4、并發(fā)揮作用。CBD-BMP與LOCS特異性結合，構建分化調控單元。
　　體外實驗我們把細胞單元和分化調控單元的混合物進行連續(xù)灌注培養(yǎng)10天，以同樣條件灌注培養(yǎng)細胞單元作為對照組。經過10天的連續(xù)灌注培養(yǎng)，實驗組和對照組均形成了直徑為2厘米，高為1.1厘米的大尺寸生物仿生骨組織。形態(tài)學觀察可知大尺寸生物仿生骨組織具有較高的細胞密度，且細胞分布均勻，死細胞較少。ALP染色、茜素紅染色、ALP活性檢測、鈣離子含量測定等均發(fā)現實驗組在鈣沉

5、積、ALP活性等方面顯著優(yōu)于對照組。實驗組連續(xù)灌注培養(yǎng)出的生物仿生骨組織更加接近正常骨組織。
　　體內實驗則是用1ml注射器把細胞單元和分化調控單元混合后注入到SD大鼠（200-225g）背部皮膚下，同樣以單注入細胞單元作為對照組。SD大鼠在相同的飼養(yǎng)條件下生長30天。30天后，用戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠后、切開皮膚、鈍性分離暴露生物仿生骨組織后取出組織，實驗組可見橢圓形骨組織生成，組織質地較硬，形態(tài)規(guī)整。HE染色、ALP染色、茜素