ApoBR在布魯氏菌胞內(nèi)寄生中的功能研究.pdf

1、布魯氏菌病是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人畜共患傳染病,人感染布病后的臨床癥狀主要表現(xiàn)為波浪熱;動物感染后主要為流產(chǎn)、睪丸炎等癥狀。布魯氏菌可長期寄生在巨噬細胞內(nèi)并抑制感染細胞的凋亡,引起人、畜的多器官損傷和慢性感染,給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來嚴重威脅。因此,對布魯氏病的發(fā)病機制進行研究,尋找有效的治療性藥物和有效的疫苗迫在眉睫。
　　目的:在本實驗室黃小強篩選到與布魯氏菌 OMP25互作的宿主蛋白為ApoBR,其在布

2、魯氏菌侵染巨噬細胞中的作用并不清楚,為了了解ApoBR的作用而展開研究。本文通過RNAi等技術(shù)探討ApoBR在布魯氏菌侵染巨噬細胞中的作用,為布魯氏菌逃避巨噬細胞殺傷作用的機制和抑制腫瘤壞死因子信號通路方面的調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:(1)應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)將ApoBR蛋白的基因應(yīng)用siDESIGN Center網(wǎng)頁設(shè)計干擾片段并合成,將合成的干擾片段連接到干擾載體pSIREN-RetroQ-ZsGreen上,構(gòu)建10個干擾載

3、體,通過qRT-PCR對干擾載體進行初篩,篩選出抑制效果較為明顯的RNAi干擾片段。(2)將初篩獲得的RNAi干擾片段,構(gòu)建 RNAi慢病毒載體 pLentiLox3.7-X( X分別為干擾片段ApoBR-253、ApoBR-893、ApoBR-1325和ApoBR-2053),進一步篩選出更高效的RNAi干擾片段。(3)用牛種布魯氏菌S2308侵染高效轉(zhuǎn)染RNAi慢病毒載體的小鼠巨噬細胞,在4h、8h、12h、24h收集細胞和上清,細

4、胞用裂解液裂解,梯度稀釋,進行胞內(nèi) CFU計數(shù),上清用于 ELISA檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)的變化。裂解侵染的轉(zhuǎn)染慢病毒載體的巨噬細胞,提取RNA,應(yīng)用qRT-PCR檢測促凋亡因子Bax和抑制凋亡因子Bcl-2的變化,并用流式細胞儀檢測布魯氏菌侵染的轉(zhuǎn)染慢病毒細胞的凋亡率。
　　結(jié)果:(1)測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了10個干擾載體 pSIREN-RetroQ-ZsGreen-X(X分別為 ApoBR-163、ApoBR-457、

5、ApoBR-648、ApoBR-2668、ApoBR-1138、 ApoBR-893、ApoBR-253、ApoBR-1325、ApoBR-2053、CK)。應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)和生物信息學(xué)分析比對成功篩選出4個比較高效的干擾載體pSIREN-RetroQ-ZsGreen-X(X分別為:ApoBR-253、ApoBR-893、ApoBR-1325、ApoBR-2053)。(2)成功構(gòu)建 pLentiLox3.7-253、 pLenti

6、Lox3.7-893、pLentiLox3.7-1325、pLentiLox3.7-20534個慢病毒載體,并篩選獲得2個更高效的干擾載體pLentiLox3.7-253和pLentiLox3.7-1325,抑制率高達60％以上(3)布魯氏菌2308侵染高效轉(zhuǎn)染慢病毒載體的小鼠巨噬細胞RAW264.7的CFU結(jié)果與對照組和陰性對照組相比CFU降低。ELISA檢測TNF-α結(jié)果顯示與對照組和陰性對照組相比均呈下降趨勢。流式細胞儀檢測細胞的

7、凋亡率結(jié)果顯示,與對照組和陰性對照組相比,凋亡率均升高,RT-PCR檢測Bax、Bcl-2的結(jié)果顯示,促凋亡因子 Bax相對表達量與對照組和陰性對照組相比均升高,而抑制凋亡因子 Bcl-2的結(jié)果卻相反。
　　結(jié)論:本實驗結(jié)果表明ApoBR是布魯氏菌侵染巨噬細胞的重要識別受體之一,對布魯氏菌的入侵和早期感染具有重要的作用;使用靶向 ApoBR的 RNAi慢病毒載體能有效抑制布魯氏菌在巨噬細胞中的增殖,ApoBR的表達導(dǎo)致TNF-a和