微孢根霉華根霉變種CICIM F0088生淀粉酶系的研究.pdf

1、本研究從各類樣品中分離得到365株具有淀粉水解能力的絲狀真菌并保藏于江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心,建立了一個絲狀真菌資源庫。從該資源庫中篩選出一株具有較強生淀粉水解能力的混合淀粉酶系產(chǎn)生菌株CICIM F0088。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察以及ITS序列同源性分析,確認該菌株為微孢根霉的華根霉變種(Rhizopusmicrosporus var.chinens)。研究發(fā)現(xiàn)CICIM F0088菌株在固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵時所產(chǎn)生的淀粉酶量和淀粉

2、酶系的組成均存在差異。
　　 本文首次對Rhizopus microsporus var.chinensis在固態(tài)和液態(tài)兩種發(fā)酵方式下所產(chǎn)生的淀粉酶系進行系統(tǒng)的研究和比較。經(jīng)過硫酸銨沉淀、雙水相分離、離子交換層析、制備電泳和凝膠過濾層析等五種純化方法,從CICIM F0088菌株的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到三個電泳純的酶蛋白GAA,GAB和AA,酶蛋白的分子量依次為53、52和55 kDa;采用硫酸銨沉淀、離子交換層析和制備電泳等三

3、種純化方法,從液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到兩個電泳純的酶蛋白GAC和GAD,酶蛋白分子量分別為53和52 kDa。
　　 對從CICIM F0088菌株分離純化得到的5個淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了研究,發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵時產(chǎn)生的葡萄糖淀粉酶GA A和GA B的溫度耐受范圍、pH耐受范圍以及生淀粉水解能力均優(yōu)于液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的GAC和GAD;上述四個葡萄糖淀粉酶都具有一定的生淀粉水解能力,而固態(tài)發(fā)酵時產(chǎn)生的α-淀粉酶AA不具有該能力。
　　

4、 結(jié)合Rhizopus屬來源的葡萄糖淀粉酶氨基酸保守序列及Rhizopus microsporus密碼子偏好性等信息設(shè)計簡并引物,利用PCR技術(shù)擴增得到CICIM F0088菌株葡萄糖淀粉酶編碼基因的部分DNA序列,再通過反向PCR獲得已知序列的側(cè)翼序列,最終獲得完整的編碼基因gluE。以此為基礎(chǔ),通過RT-PCR的方法擴增出了該基因完整的cDNA序列。通過比較gtuE基因的DN_A和cDNA序列發(fā)現(xiàn),gluE基因全長2763 bp,內(nèi)

5、部存在四個內(nèi)含子;該基因的cDNA全長1818 bp,其中信號肽編碼區(qū)81 bp,成熟肽編碼區(qū)共編碼579個氨基酸殘基。將成熟肽的氨基酸序列與GenBank中其他微生物來源的葡萄糖淀粉酶一級結(jié)構(gòu)進行同源性比對分析發(fā)現(xiàn),該酶與所有已知葡萄糖淀粉酶的最高同源性為80％,是一種新的葡萄糖淀粉酶。
　　 將葡萄糖淀粉酶基因gluE的cDNA序列連入pET-28a(+)表達載體,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-gluE,在Escherich