叉枝松藻抗凝血多糖及其寡糖的制備和結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、叉枝松藻，又名叉開松藻，屬于綠藻門、松藻目、松藻科、松藻屬，多生長在中、低潮帶的巖石上或石沼中。本論文以采自我國黃海海域的叉枝松藻為研究對象，采用各種色譜分離技術(shù)，獲得叉枝松藻的純品多糖，采用化學(xué)法、色譜法、波譜法對其組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，并對結(jié)構(gòu)新穎的叉枝松藻多糖進(jìn)行降解研究，建立可控酸降解方法制備低分子量多糖及寡糖，通過核磁共振技術(shù)和質(zhì)譜法，對獲得的低分子量多糖及寡糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究，并測定了叉枝松藻多糖及各種低分子量多糖的抗凝血活性。研

2、究結(jié)果如下:
　　1.以叉枝松藻為原料，依次采用冷水、熱水和0.5mol/L NaOH溶液提取多糖，分別得到3個多糖組分CP、HP和AP，相對于干燥藻體的得率分別為10.72％、8.41％和1.54％，并對其理化性質(zhì)和單糖組成進(jìn)行分析。結(jié)果表明，CP、HP和AP均為硫酸化多糖，總糖含量分別為66.7％、65.4％和44.3％;硫酸基含量分別為25.6％、11.8％和28.2％; AP的蛋白含量最高為20.4％。3種粗多糖的主要單糖

3、組成均為半乳糖，另外還含有數(shù)量不等的阿拉伯糖、葡萄糖和甘露糖。
　　2.叉枝松藻的冷水提粗多糖CP和熱水提粗多糖HP，首先采用Q-SepharoseFast F low強(qiáng)陰離子色譜柱分離純化，獲得CP1、CP2和HP1三個組分，經(jīng)SephacrylS-400凝膠柱層析進(jìn)一步純化，得到3個純品多糖組分CP1-1、CP2-1和HP1-1。通過化學(xué)方法對多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行測定，結(jié)果表明，CP1-1、CP2-1和HP1-1的總糖含量分別為

4、62.4％、64.8％和78.1％;蛋白含量分別為0.5％、0.4％和3.1％;硫酸基含量分別為30.4％、23.7％和12.3％;糖醛酸含量分別為4.5％、3.2％和6.7％;CP2-1的丙酮酸含量為6.6％。采用高效凝膠滲透色譜法測定三種多糖的分子量分別為203kDa、37.9kDa、297kDa。采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測定單糖組成，結(jié)果表明，CP1-1主要由阿拉伯糖和半乳糖組成;CP2-1主要含有半乳糖;HP1-1主要含

5、有葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。另外，采用高效液相色譜法測定多糖中主要單糖種類的絕對構(gòu)型，阿拉伯糖的絕對構(gòu)型為L，半乳糖和葡萄糖的絕對構(gòu)型為D。
　　通過紅外光譜、脫硫反應(yīng)、甲基化后GC-MS分析和1D，2D NMR對多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，CP1-1、CP2-1和HP1-1的結(jié)構(gòu)各不相同。CP1-1主要含有[→4)-β-L-Arap-（1→]、[→3)-β-D-Galp-（1→]、[β-D-Galp-(1→]和[→3，4)-β-D-Gal

6、p-（→]連接方式，硫酸基取代于1，4連接阿拉伯糖的C-3位和1，3連接半乳糖的C-4位。CP2-1是半乳聚糖，以1，3連接半乳糖為主鏈，含有[→3)-β-Galp-(1→]、[→3,4)-β-Galp-(1→]、[→3)-β-(4SO4)-Galp-(1→]、[β-(3，4-Pyr，6SO4)-Galp-(1→]，硫酸基取代于1，3連接半乳糖的C-4位和非還原末端半乳糖的C-6位，丙酮酸在非還原末端半乳糖的C-3和C-4位形成五元環(huán)。

7、HP1-1含有[→4)-α-Glcp-(1→]、[→3)-α-Glcp-(1→]、[→3，4)-α-Glcp-(1→]、[→4)-β-Arap-(1→]、[β-D-(3，4Pyr)-Galp-(1→]、[→3)-β-D-Galp-（1→]多種連接方式，少量硫酸基位于1，4連接葡萄糖的C-3位和1，3連接半乳糖的C-4位。通過APTT、PT和TT，對多糖CP1-1、CP2-1和HP1-1的抗凝血活性進(jìn)行評價，結(jié)果表明，CP1-1、CP2-

8、1和HP1-1均具有體外抗凝血活性，但低于肝素。
　　3.采用硫酸對叉枝松藻多糖CP1進(jìn)行降解，通過薄層色譜法和高效凝膠滲透色譜法對降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，優(yōu)化降解條件。最終選用0.05mol/L硫酸于40℃水浴中降解1.5h和0.01 mol/L硫酸于60℃水浴中降解3h兩種條件對多糖CP1進(jìn)行降解，采用凝膠色譜Sephacryl S-400分離純化，獲得6個低分子量多糖組分L1～L6，分子量分別為369kDa、242kDa、124k

9、Da、102kDa、43kDa、22kDa。對其進(jìn)行化學(xué)組成分析，6種低分子量多糖均由阿拉伯糖和半乳糖組成，只是單糖的比例有所不同，硫酸基含量在22.5％～29.9％范圍內(nèi)，與母體多糖的化學(xué)組成相似。以抗凝血活性較好、分子量較小的L5為代表，通過GC-MS和1D，2D NMR對L5進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，結(jié)果表明，多糖L5主要含有[→3)-Galp-(1→]、[→4)-Galp-(1→]、[→4)-Arap-(1→]等連接方式，硫酸基位于1，3連

10、接半乳糖的C-2和C-4位，1，4連接半乳糖的C-2位，1，4連接阿拉伯糖的C-3，L5為高度硫酸化的阿拉伯半乳聚糖。采用APTT測定多糖CP1及降解產(chǎn)物L(fēng)1～L6的抗凝血活性，結(jié)果表明，多糖的抗凝血活性隨著分子量的減小而降低，說明一定長度的多糖鏈?zhǔn)潜匦璧模肿恿繉Σ嬷λ稍宥嗵堑目鼓钚跃哂兄匾绊憽?br>　　4.叉枝松藻多糖CP2-1通過三氟乙酸降解，經(jīng)Bio-Gel P4凝膠色譜柱分離純化后，得到8個不同聚合度的寡糖組分F1～F

11、8，并對其純度進(jìn)行分析。通過負(fù)離子模式的電噴霧一級質(zhì)譜(ES-MS)對寡糖的組成成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明，F(xiàn)1～F8為聚合度(DP)在1～11之間的半乳寡糖，且有丙酮酸和硫酸基取代。以純度較高、由G2S組成的F3為代表進(jìn)行核磁和二級質(zhì)譜分析，確定其結(jié)構(gòu)為β-D-Galp-(4SO4)-(1→3)-D-Gap，并建立硫酸化半乳寡糖負(fù)離子模式下ES-CID-MS/MS二級質(zhì)譜序列分析方法。將此方法用于其它半乳寡糖的分析，結(jié)果表明，獲得的半乳寡

12、糖均通過1→3糖苷鍵相連，硫酸基多數(shù)在1，3連接半乳糖的C-4位，少數(shù)在非還原末端半乳糖的C-6位，丙酮酸在非還原末端半乳糖的C-3和C-4位形成五元環(huán)。通過分析歸屬半乳寡糖的斷裂碎片，建立了半乳寡糖ES-CID-MS/MS二級質(zhì)譜序列分析方法，有助于多糖及寡糖結(jié)構(gòu)的研究，獲得的半乳寡糖是結(jié)構(gòu)新穎的海洋特征寡糖。
　　本論文的研究成果，加深了人們對叉枝松藻多糖結(jié)構(gòu)和活性的認(rèn)識，為開發(fā)利用叉枝松藻奠定了基礎(chǔ)，豐富了“海洋糖庫”的數(shù)據(jù)