囊礁膜硫酸多糖及其寡糖的結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、綠藻門石莼目中的綠藻多糖大多數(shù)為硫酸化多糖,其生物活性具有多樣性,如抗凝血活性、抗氧化性、調(diào)血脂、抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用等,硫酸化多糖的結(jié)構(gòu)研究是硫酸化多糖開發(fā)與應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。本論文以綠藻門石莼目礁膜屬的囊礁膜為研究對象,采用各種色譜分離技術(shù),獲得囊礁膜硫酸多糖,采用化學(xué)和現(xiàn)代波譜方法對其結(jié)構(gòu)進行研究。研究結(jié)果如下:
　　1、囊礁膜藻粉經(jīng)冷水、熱水提取,得到冷水提多糖CMK和熱水提多糖HMK,其得率分別為27.28％和19

2、.62%,通過離子交換色譜和凝膠滲透色譜純化,主要得到三種多糖CMKS-1、CMKS-2和HMKS,經(jīng)過脫硫反應(yīng)得到相應(yīng)的脫硫多糖dsCMKS-1、dsCMKS-2和dsHMKS。采用柱前PMP衍生高效液相色譜檢測各個多糖組分的單糖組成,結(jié)果表明CMKS-1、CMKS-2和HMKS含有73.64~78.84%的鼠李糖,CMKS-1和 CMKS-2葡萄糖含量(10.74~13.77%)高于 HMKS(約4.73%),另外,三種多糖還含有少

3、量葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖及甘露糖;通過紅外光譜法可知三種水溶性多糖均含有硫酸基的特征吸收峰;通過化學(xué)方法對總糖含量、硫酸基含量及蛋白質(zhì)含量進行測定,結(jié)果表明,多糖CMKS-1、CMKS-2和HMKS的總糖含量分別為54.21%、51.16%和54.33%,硫酸基含量為23.86%、22.52%和25.84%,蛋白質(zhì)含量較低。通過高效凝膠滲透色譜法測得多糖CMKS-1、CMKS-2和HMKS的分子量分別為283.8kDa、73.5 kD

4、a和926.5 kDa。
　　通過甲基化分析和核磁共振波譜(1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、1H-13C HMQC、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC、1H-1HNOESY)等技術(shù)對多糖結(jié)構(gòu)進行解析,多糖 dsHMKS由二糖單元[α-L-Rhap(1→3)-α-L-Rhap(1→、[α-L-Rhap(1→2)-α-L-Rhap(1→]、[→3)-α-L-Rhap(1→3)-α-L-Rhap(1→][

5、→2)-α-L-Rhap(1→3)-α-L-Rhap(1→]和[→2)-α-L-Rhap(1→2)-α-L-Rhap(1→]或連續(xù)或交替重復(fù)排列構(gòu)成的,并以糖基片段[→3)-α-L-Rhap(1→3)-α-L-Rhap(1→]為主;CMKS-1和CMKS-2的結(jié)構(gòu)極為相似,主要由糖基片段[→3)-α-L-Rhap(1→]和[→2)-α-L-Rhap(1→]組成,并且硫酸基團主要位于[→3)-α-L-Rhap(1→]的 C-2位羥基和[→

6、2)-α-L-Rhap(1→]的C-3位羥基上,非還原末端鼠李糖[α-L-Rhap(1→]的C-2、C-3、C-4位羥基也可被硫酸酯化。
　　2、采用三氟乙酸降解法對多糖 HMKS進行降解,在不同的酸濃度(0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L)以及不同溫度(60℃、80℃、100℃)反應(yīng)條件下得到分子量858.58~1.28 kDa之間的27種多糖組分。通過甲基化與1H NMR,13C NMR,1H-1H CO

7、SY,1H-13C HMQC,1H-13C HMBC等技術(shù)對分子量約為16.51 kDa的低分子量多糖 QSA的結(jié)構(gòu)進行解析,發(fā)現(xiàn)其以[→3)-α-L-Rhap(1→]鼠李糖為主,并含有[→3)-α-L-Rhap(2SO42-)(1→]、[→2)-α-L-Rhap(3SO42-)(1→]、[→2)-α-L-Rhap(1→]、[→2,3)-α-L-Rhap(1→],以及少量的[→2)-α-L-Rhap(4SO42-)(1→]鼠李糖等結(jié)構(gòu)片

8、段,其非還原末端鼠李糖環(huán)上的游離羥基均可被硫酸酯化,并推測其可能含有硫酸酯化的葡萄糖。
　　3、以多糖 HMKS為原料采用三氟乙酸降解獲得囊礁膜寡糖片段,通過凝膠滲透色譜分離純化,得到不同聚合度的寡糖組分,并通過 TLC、甲基化分析、ESI-MS對寡糖組分的純度、糖苷鍵的連接方式、聚合度以及結(jié)構(gòu)進行了分析。通過甲基化分析與負(fù)離子模式下二級質(zhì)譜ESI-CID-MS/MS分析了聚合度為2~4的單硫酸化寡糖的結(jié)構(gòu),并確定了硫酸化鼠李單糖

9、中糖環(huán)C-3位羥基硫酸酯化,硫酸化鼠李二糖的結(jié)構(gòu)為α-L-Rhap(3SO4)-(1→3)-α-L-Rhap和α-L-Rhap(2SO4)-(1→3)-α-L-Rhap兩種連接方式組成,硫酸化鼠李糖-葡萄糖醛酸二糖的結(jié)構(gòu)為α-L-Rhap(3SO4)-(1→4)-β-D-GlcAp、α-L-Rhap(2SO4)-(1→4)-β-D-GlcAp、β-D-GlcAp(4SO4)-(1→3)-α-L-Rhap和β-D-GlcAp(4SO4)-