糖蛋白寡糖結(jié)構(gòu)分析方法優(yōu)化及其在食物源寡糖結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用.pdf

1、糖蛋白作為生物體的主要組成和功能物質(zhì)，參與了所有的生命活動(dòng)，具有重要的生物學(xué)功能，其中糖基化發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。蛋白質(zhì)的糖基化類型主要有兩種:N-糖基化和O-糖基化，相應(yīng)的糖蛋白寡糖也分為N-鏈寡糖和O-鏈寡糖。目前對(duì)于這兩種蛋白寡糖已經(jīng)有了比較普遍應(yīng)用的分析方法，但無(wú)論是N-還是O-鏈寡糖，它們的結(jié)構(gòu)分析方法都存在著不足。本文即是針對(duì)目前N-鏈和O-鏈寡糖結(jié)構(gòu)分析方法所存在的問(wèn)題對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，并利用優(yōu)化后的方法對(duì)食物源中的兩種寡糖進(jìn)

2、行結(jié)構(gòu)分析上的應(yīng)用。
　　1.食物源N-鏈寡糖結(jié)構(gòu)分析方法的優(yōu)化和應(yīng)用
　　從糖蛋白上將糖鏈解離下來(lái)是進(jìn)行糖鏈分析的首要步驟，而目前廣泛使用的解離N-鏈寡糖的工具是PNGase F和PNGase A酶，但兩種酶皆有不足之處。本實(shí)驗(yàn)室前期從細(xì)菌Terriglobus roseus中發(fā)現(xiàn)了一種編碼新型N-糖酰胺酶PNGase H+的基因，重組表達(dá)的PNGase H+有如下優(yōu)點(diǎn):可以作用于所有類型的N-糖鏈;無(wú)論是糖肽還是糖蛋白都

3、可以作為有效底物;本身不是糖蛋白，不會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生干擾。
　　以上述PNGase H+為基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)試劑和流程，建立了酶解釋放糖蛋白更加快速、便捷的方法。由于PNGase H+在酸性條件下具有高活性，因此在利用酸性反應(yīng)液進(jìn)行糖鏈解離后，用相同反應(yīng)液直接進(jìn)行2-氨基苯甲酰胺(2-AB)的熒光標(biāo)記，大大縮短了樣品處理、反應(yīng)與檢測(cè)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)以辣根過(guò)氧化物酶為模型糖蛋白對(duì)酸性反應(yīng)液的濃度與反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明在1 m

4、ol/L乙酸條件下，反應(yīng)兩個(gè)小時(shí)可以完全酶解釋放糖蛋白上的N-鏈寡糖。與傳統(tǒng)方法相比，本方法不會(huì)造成樣品的損失。通過(guò)對(duì)不同的底物濃度進(jìn)行分析驗(yàn)證了方法的穩(wěn)定性與實(shí)用性。
　　利用這種新型方法使用高效液相對(duì)各種植物來(lái)源的糖蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明，所有樣品處理步驟不超過(guò)四小時(shí)，不需要長(zhǎng)時(shí)間的純化和真空干燥步驟。與MALDI-ToF-MS質(zhì)譜聯(lián)用后，進(jìn)一步成功地對(duì)水果、蔬菜和蘑菇中的糖蛋白N-鏈寡糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)解析，從而找出了不同種類

5、食物中所含有的N-鏈寡糖的種類和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
　　2.食物源O-鏈寡糖的結(jié)構(gòu)分析方法優(yōu)化和應(yīng)用
　　相比于N-鏈寡糖，O-鏈寡糖的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，且迄今為止沒(méi)有一種像PNGase類的酶可以將所有O-鏈寡糖從蛋白質(zhì)分子上解離下來(lái)，目前可供選擇的只有化學(xué)法。其中，β-消除法以氨水為介質(zhì)、反應(yīng)條件較溫和、解離O-鏈寡糖效果較好，但該方法存在著糖鏈降解現(xiàn)象。
　　本實(shí)驗(yàn)在已有方法的基礎(chǔ)上，從糖鏈解離效率最大化和剝皮反應(yīng)最小化兩個(gè)方