海洋硫酸半乳聚糖特異性降解、寡糖和糖脂的制備與序列分析及其寡糖芯片的構(gòu)建.pdf

1、本論文以幾種海洋硫酸半乳聚糖為研究對象，采用酸法和自由基氧化法和現(xiàn)代色譜分離技術(shù)獲得了120種寡糖，通過還原胺化方法制備了30種擬糖脂生物探針，并運用生物質(zhì)譜技術(shù)確定了它們的結(jié)構(gòu)序列。 首先，運用電噴霧碰撞誘導(dǎo)串聯(lián)質(zhì)譜(ES-CID-MS/MS)技術(shù)，分析了14種不同結(jié)構(gòu)特征的具有代表性的卡拉膠寡糖的序列，總結(jié)了不同寡糖在質(zhì)譜分析中產(chǎn)生的糖基碎片信息，發(fā)現(xiàn)并成功解決了硫酸寡糖質(zhì)譜分析中硫酸根易脫落的問題，找到了不同結(jié)構(gòu)的寡糖二級

2、質(zhì)譜碎片離子的斷裂規(guī)律，從理論上解釋了產(chǎn)生特殊離子碎片的原因，最終建立了硫酸半乳寡糖微量序列分析的質(zhì)譜學(xué)方法。這些規(guī)律同樣適用于其它硫酸寡糖序列分析。所建立的微量寡糖序列分析方法為卡拉膠類寡糖的構(gòu)效關(guān)系研究提供了重要技術(shù)支持。 以κ-、τ-和λ-卡拉膠、瓊膠和脫硫λ-卡拉膠為原料，采用溫和稀酸降解法制備了系列寡糖并用ES-CID-MS/MS技術(shù)確定了其序列。獲得了90個寡糖單體，其中40種寡糖單體為首次報道。從位阻效應(yīng)和環(huán)張力效

3、應(yīng)出發(fā)，以特異酸解條件制備了聚合度3～19的κ-卡拉膠奇數(shù)硫酸寡糖和聚合度3～19的瓊膠奇數(shù)寡糖；根據(jù)3，6-內(nèi)醚半乳糖的酸不穩(wěn)定性，進而選用了還原性弱酸降解制備了聚合度2～24的κ-卡拉膠偶數(shù)硫酸寡糖醇與2～20的偶數(shù)瓊膠寡糖醇系列寡糖；根據(jù)C2位硫酸基拉電子誘導(dǎo)效應(yīng)及稀酸對α-1，3和β-1，4糖苷鍵水解選擇性的差異，制備了聚合度2～20的τ-卡拉膠偶數(shù)硫酸寡糖及其糖醇，本技術(shù)具有擬c[.瓊膠酶和α-卡拉膠酶特異性降解特點，但卻制備

4、了結(jié)構(gòu)不同于酶法制備的寡糖化合物，其成本又遠(yuǎn)低于生物酶法。含有3，6-內(nèi)醚半乳糖的多糖易被稀無機酸和有機酸以及固體酸如各種酸性陽離子交換樹脂降解而得到全部為奇數(shù)的罕見降解結(jié)果，在大量實驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，首次闡明了這種能夠特異性獲得奇數(shù)寡糖的降解機理。 在上述降解機理的指導(dǎo)下，以一種紅藻多糖為原料，采用分步降解法制備了14種雜合寡糖并確定了它們的序列，為復(fù)雜紅藻多糖的結(jié)構(gòu)研究提供了方法學(xué)參考。此外，進一步評價了系列雜合硫酸半乳寡糖對

5、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和β-分泌酶(BACE)抑制活性，結(jié)果顯示：在648μg/mL下，組分M4具有一定抑制ACE活性，抑制率為10.4％，具有弱降壓活性；在100μg/mL下，低分子量組分M1，M2和M3抑制BACE分別為42.5％，31.1％和47.6％，表明具有一定抗老年癡呆活性，但高分子量組分則無活性。該結(jié)果為從事其它硫酸半乳寡糖構(gòu)效關(guān)系的研究、生物活性評價提供了基礎(chǔ)。 在對硫酸半乳多糖的自由基氧化降解實驗中，采用正

6、交實驗設(shè)計法確定了自由基降解的最佳條件，獲得了系列自由基降解產(chǎn)物，并通過質(zhì)譜技術(shù)成功分析了復(fù)雜產(chǎn)物中的寡糖結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果表明，自由基降解是一種非特異性的降解方法，所得寡糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，這為獲得結(jié)構(gòu)豐富多樣且新穎的寡糖提供了有效方法。此外，通過對產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，該方法沒有硫酸根的脫落問題，能夠較好的保留多糖分子中的硫酸酯基團，有利于某些生物活性的評價。通過此降解方法獲得了3個系列30多種寡糖和雜合硫酸半乳寡糖組分，首次獲得了結(jié)構(gòu)新穎的κ-和τ

7、-卡拉膠寡糖酸。 為了深入研究寡糖與蛋白相互作用，快速篩選活性寡糖化合物，利用上述寡糖為原料，進一步采用還原氨胺化技術(shù)探討了擬糖脂生物探針的合成，獲得了30種擬糖脂，并運用生物質(zhì)譜技術(shù)確定了它們的結(jié)構(gòu)。這些寡糖脂為糖芯片的構(gòu)建，以及進一步從事寡糖與蛋白之間的相互作用研究提供了基礎(chǔ)。 綜上所述，本文以多種硫酸半乳寡糖為研究對象，系統(tǒng)建立了一種微量簡便的生物質(zhì)譜學(xué)方法，該方法能確定各種硫酸半乳寡糖的序列，并在對寡糖產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的