中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)融合抑制劑的研究.pdf

1、2012年，一種被稱為中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的新型冠狀病毒在中東地區(qū)流行。該病毒可以引起SARS樣的疾病，導(dǎo)致多器官功能的衰竭，在人群中造成約40％的病死率。由于MERS-CoV具有人傳人的能力，因而存在在人群中大規(guī)模流行的可能性，因此，急需盡快對(duì)MERS-CoV進(jìn)行深入研究，以尋找其藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)并開發(fā)相應(yīng)的抗MERS-CoV藥物，用于患者的臨床治療以及預(yù)防MERS-CoV潛在的大流行可能。
　　本文對(duì)MERS

2、-CoV S蛋白HR1和HR2所形成的六螺旋（6-HB）核心結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，分析MERS-CoV感染宿主細(xì)胞的膜融合機(jī)制。在晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)和檢測(cè)衍生于MERS-CoV S蛋白的候選融合抑制劑，以用于對(duì)MERS-CoV感染的預(yù)防和治療。
　　我們首先下載了MERS-CoV(hCoV-EMC)S蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列。通過與SARS-CoV的S蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，明確了其功能分區(qū)。包括融合肽(aa943-982)、HR1(aa984-

3、1104)、HR2(aa1246-1295)、跨膜區(qū)(aa1296-1318)、和胞內(nèi)區(qū)(aa1319-1353)。
　　為了解析MERS-CoV S蛋白融合核心的晶體結(jié)構(gòu)，我們通過L6(SGGRGG)連接HR1和HR2的核心區(qū)域(aa984-1062、aa1245-1289)，構(gòu)建融合表達(dá)蛋白，并進(jìn)一步解析其晶體。晶體結(jié)果顯示，MERS-CoV的融合核心(HR1-L6-HR2)呈現(xiàn)典型的6-HB結(jié)構(gòu):外形呈棒狀、長(zhǎng)度約112、直

4、徑約27;HR1呈螺旋形平行排列為三聚體，三個(gè)HR2螺旋反向平行的附著在HR1之間形成的疏水溝。其中，6-HB的核心區(qū)域由HR1的aa987-1062與HR2的aa1263-1279形成。另外，HR2螺旋區(qū)域外側(cè)的N-端和C-端區(qū)域均有疏水氨基酸與HR1形成的疏水溝相作用。另外，HR2和其相鄰的兩個(gè)HR1之間還能形成11條氫鍵，它們集中分布在HR2螺旋區(qū)域的N-端和C-端，該結(jié)構(gòu)進(jìn)一步穩(wěn)定了HR2與HR1中央疏水溝之間的結(jié)合。
　

5、　基于以上結(jié)構(gòu)，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了覆蓋HR1與HR2相互作用區(qū)域的兩條多肽HR1P和HR2P。通過使用Native-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，HR1P/HR2P的作用產(chǎn)物具有一條與HR1P和HR2P位置不同的新的電泳條帶。使用SE-HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HR1P和HR2P作用產(chǎn)物中存在一個(gè)分子量大于HR1P以及HR2P的新的檢測(cè)峰。說明兩者可以相互作用形成聚合物。而后，我們使用Laemmli上樣緩沖液，在不煮沸的情況下進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果顯示H

6、R1P/HR2P復(fù)合物的大小在26 kDa左右，符合HR1P與HR2P形成的六聚物大小。圓二色譜(CD)顯示HR1P/HR2P的復(fù)合物呈現(xiàn)高度的α-螺旋結(jié)構(gòu)，且具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，Tm約87℃。以上結(jié)果證實(shí)，MERS-CoV S蛋白HR1和HR2結(jié)構(gòu)域的衍生肽可以形成6-HB。提示可以以HR1P與HR2P為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)MERS-CoV的候選融合抑制劑。
　　為了檢測(cè)HR1P和HR2P對(duì)MERS-CoV的抑制活性，我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了基于M

7、ERS-CoV S蛋白的細(xì)胞-細(xì)胞融合模型。我們通過構(gòu)建能同時(shí)表達(dá)MERS-CoV S蛋白以及EGFP的質(zhì)粒pAAV-IRES-GFP-MERS-S，瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞(293T/MERS/EGFP)作為效應(yīng)細(xì)胞，以能夠表達(dá)DPP4的Huh-7作為靶細(xì)胞共同孵育。同時(shí)使用只表達(dá)EGFP的293T細(xì)胞(293T/EGFP)作對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，37℃培養(yǎng)4h后，293T/MERS/EGFP能夠和Huh-7融合。而陰性對(duì)照293T/EGFP則不會(huì)

8、與Huh-7細(xì)胞融合。
　　然后，我們?cè)谠撓到y(tǒng)上測(cè)定了HR1P、HR2P、T20（抗HIV-1多肽）和SC-1（SARS-CoV S蛋白的HR2多肽）的抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HR2P顯示出較強(qiáng)的抑制效果（IC50約0.8μM），而HR1P、T20和SC-1沒有明顯的抑制活性。
　　之后，我們進(jìn)一步在MERS-CoV感染Vero細(xì)胞模型上測(cè)試了抑制活性，結(jié)果顯示，HR2P可顯著抑制MERS-CoV的復(fù)制（IC50約0.6μM）;而

9、HR1P、T20和SC-1沒有明顯抑制活性。此外，HR2P還可以有效抑制MERS-CoV感染Calu-3細(xì)胞(IC50=0.6μM)。而在HFL細(xì)胞上，其效果大大降低(IC50=13.9μM)。推測(cè)可能由于MERS-CoV進(jìn)入細(xì)胞的途徑不同，從而導(dǎo)致了抑制效果的不同。另外，HR2P不能交叉抑制SARS-CoV假病毒感染293T/ACE2細(xì)胞的活性，表明HR2P是一個(gè)特異性的MERS-CoV融合抑制劑。
　　為了確證HR2P的作用機(jī)

10、制，我們使用假病毒進(jìn)行了time-of-addition實(shí)驗(yàn)以及使用細(xì)胞-細(xì)胞融合模型進(jìn)行了time-of-removal實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，HR2P作用于病毒進(jìn)入的早期階段，并且靶向結(jié)合于MERS-CoV的S蛋白。
　　為了進(jìn)一步提高HR2P的抑制效果，我們進(jìn)一步引入谷氨酸(E)和賴氨酸(K)/精氨酸(R)突變。我們按照i到i+4或i到i+3的方式，設(shè)計(jì)了引入兩個(gè)突變T1263E、L1267R的HR2P-M1。以及7個(gè)點(diǎn)突變的HR2

11、P-M2包括T1263E、L1267K、S1268K、Q1270E、Q1271E、A1275K和N1277E。通過形成EK、KE或ER鹽橋，從而增加了多肽自身的螺旋度。同時(shí)，這些突變還增加了多肽的親水性及水溶性。圓二色譜顯示，改造后多肽的α-螺旋比HR2P有所提高、與HR1P形成的復(fù)合物的α-螺旋度和Tm值也高于HR1P/HR2P，可見，引入的鹽橋增加了符合物的穩(wěn)定性。另外，HR2P-M1和HR2P-M2在H2O中的溶解度也增加了大約6

12、8倍和1786倍。而在MERS-CoV S蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合模型上的抑制活性也分別增加約9％和69％。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)解析了MERS-CoV S蛋白HR1和HR2形成的6-HB晶體結(jié)構(gòu)，并在此基礎(chǔ)之上，設(shè)計(jì)了衍生于HR1和HR2相互作用區(qū)域的多肽HR1P及HR2P。證明了兩條多肽具有形成6-HB的生物活性。其中HR2P能有效地抑制MERS-CoV病毒的復(fù)制以及其S蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合。之后我們進(jìn)一步在HR2P的氨基