中東呼吸綜合征冠狀病毒受體結(jié)合區(qū)蛋白在昆蟲細(xì)胞中的重組表達(dá)與免疫保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：
　　利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)MERS-CoV S1和RBD蛋白，明確其作為重組疫苗靶抗原的免疫原性和誘導(dǎo)中和抗體的能力；利用制備的S1重組蛋白篩選制備具有中和活性的抗MERS-CoV單克隆抗體。
　　方法：
　?。?）構(gòu)建含有MERS-CoV S1基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞包裝桿狀病毒。重組病毒傳代3次獲得種子病毒，感染Sf9細(xì)胞，收獲感染上清，通過鎳離子親和層析純化獲得S1重組蛋白。利用純

2、化的S1蛋白免疫BALB/c小鼠，通過ELISA檢測免疫小鼠血清抗原特異性的抗體水平；通過假病毒以及活病毒中和試驗(yàn)檢測血清中抗體的中和活性。同時利用重組表達(dá)S1蛋白免疫BALB/c小鼠，將免疫后小鼠脾細(xì)胞與 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，通過ELISA篩選出陽性克隆，隨后通過多次亞克隆篩選出穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，制備單抗腹水并進(jìn)行抗體效價(jià)測定及亞類鑒定；通過MERS-CoV假病毒及活病毒中和試驗(yàn)篩選出中和單抗。
　?。?）

3、利用生物信息學(xué)方法對MERS-CoVS1基因序列、二級結(jié)構(gòu)、柔性分析；同時對MERS-CoV RBD、MERS-CoV單克隆抗體及MERS-CoV RBD與細(xì)胞受體DPP4結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測在S1內(nèi)部具有免疫保護(hù)功能區(qū)段355-590aa；針對預(yù)測的免疫功能保護(hù)區(qū)設(shè)計(jì)添加foldon序列，構(gòu)建含有MERS-CoV RBD、MERS-CoV RBD Fd基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞包裝桿狀病毒。重組病毒傳代3次獲得種子病

4、毒進(jìn)而感染Sf9細(xì)胞，收獲感染上清，通過鎳離子親和層析純化獲得 RBD、RBDFd重組蛋白。利用純化的重組蛋白免疫 BALB/c小鼠，通過ELISA檢測免疫小鼠血清抗原特異性的抗體水平；通過假病毒以及活病毒中和試驗(yàn)檢測血清中抗體的中和活性。
　　結(jié)果：
　?。?）獲得了表達(dá) MERS-CoV S1蛋白的重組病毒株，并在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)和純化了分子量約140kD S1重組蛋白。利用重組表達(dá)的S1蛋白免疫小鼠三次，血清S1特異

5、性IgG抗體滴度可達(dá)1:102400；免疫小鼠血清稀釋5120倍后中和百分比仍能達(dá)到50％以上，且具有良好的活病毒中和活性。
　　（2）利用重組的MERS-CoV S1蛋白篩選獲得了10株能夠穩(wěn)定分泌抗原特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株。制備的腹水單抗亞類為6株為 IgG1型，2株為IgG2a型，2株為IgM型；10株單抗抗體ELISA效價(jià)達(dá)到10000以上，并獲得1株單抗對MERS-CoV具有良好的中和活性。
　　（3）獲得了表達(dá)

6、MERS-CoV RBD、MERS-CoV RBD Fd蛋白的重組病毒株，在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)并純化了分子量約40kD MERS-CoV RBD單體重組蛋白以及分子量約100kD MERS-CoV RBDFd寡聚體蛋白。利用重組表達(dá)的RBD單體蛋白免疫小鼠三次，血清MERS-CoV RBD特異性IgG抗體滴度可達(dá)1:6400；免疫小鼠血清稀釋3200倍后中和百分比低于50%，對MERS-CoV假病毒的中和活性較弱。而利用形成寡聚體的RB

7、D蛋白在一次加強(qiáng)免疫后，血清中MERS-CoV RBDFd特異性IgG抗體滴度可達(dá)1:102400；免疫小鼠血清稀釋12800倍后中和百分比仍高于50%。
　　結(jié)論：
　　利用昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)的MERS-CoV S1蛋白具有良好的免疫原性，并能夠有效誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度保護(hù)性中和抗體，篩選制備出一株具有良好中和活性的MERS-CoV單克隆抗體。重組表達(dá)的MERS-CoV RBD單體蛋白免疫原性以及對假病毒中和活性都較弱；利用昆蟲細(xì)