TLRs和IFIT3在豬繁殖與呼吸綜合征病毒先天性免疫中的作用.pdf

1、近20年來，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是目前危害世界養(yǎng)豬業(yè)最為嚴重的病原之一，現(xiàn)有的商品化疫苗僅能提供部分保護力。宿主先天性免疫為抗病毒保護作用的第一道防線，并能介導獲得性免疫抵抗病毒感染。然而，有些病毒可以逃逸先天性免疫監(jiān)視造成持續(xù)感染從而可能導致病原流行。PRRSV可以誘導宿主產生先天性免疫，但其機制尚不十分清楚。
　　本研究克隆獲得豬TLR2、3、7、8和9共5種Toll樣受體基因，建立了TaqMan實時定量PCR

2、方法;豬體試驗發(fā)現(xiàn)PRRSV不同毒力毒株誘導的TLR2、3、7和8基因、TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10細胞因子表達水平有較大差異;TLR3和TLR7/8配體能有效地提高PRRSV抗原豬體免疫保護效率;Poly(I∶C)通過IFIT3介導MAVS信號通路抑制PRRSV復制;成功構建了TLR3啟動子熒光素酶報告質粒，發(fā)現(xiàn)PRRSV非結構蛋白中Nsp1和Nsp4能顯著抑制豬TLR3啟動子活性，從而為豐富了PRRSV免

3、疫機制理論基礎，為研究安全有效的新型疫苗提供了新的思路。
　　主要研究內容分為以下7個部分:
　　1.豬五種Toll樣受體基因克隆與序列分析
　　利用RT-PCR方法，從杜洛克×（長白×黑豬）二元雜交豬的肺泡巨噬細胞（PAMs）中擴增獲得豬TLR2、3、7、8和9基因，分別克隆至pMD18-T載體，基因測序結果為:豬TLR2、3、7、8和9基因長度分別為2358bp、2718bp、3153bp、3087bp和3093b

4、p，分別編碼786、906、1051、1029和1031個氨基酸。同源性分析結果顯示，它們與GeneBank中豬TLR的相應序列同源性達99％以上，與牛、馬、羊和人的同源性較高，與鼠的同源性次之，而與雞的同源性最低，為豬TLRs在PRRSV感染中的作用研究奠定了基礎。
　　2.豬五種Toll樣受體TaqMan實時RT-PCR檢測方法的建立
　　根據GenBank中TLR2、3、7、8和9的基因序列，設計并合成各自特異性引物及

5、探針，以含TLRs基因的重組質粒為模板，通過對PCR反應條件的優(yōu)化，建立實時熒光定量PCR方法。并應用該方法檢測PRRSV感染或poly(I∶C)刺激后PAMs中TLRsmRNA的相對水平。結果表明，TLRs基因的Ct值與陽性質粒濃度均呈良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.99。該方法具有較高的靈敏性，檢測核酸分子DNA的下限為50copies/μL，組內、組間變異系數(shù)保持在2.3％以內。Poly(I∶C)刺激36h后，PAMs中TLR3

6、mRNA水平顯著升高;PRRSV感染36h后，PAMs中TLR2、3、7、8mRNA水平顯著升高。該方法的建立為豬TLRs的定量分析提供有有效工具。
　　3.PRRSV不同毒力毒株誘導Toll樣受體和細胞因子表達特性的比較
　　將24頭仔豬平均分成4組，每組6頭，分別接種高致病性PRRSV分離株BB0907(HP)，低毒力PRRSV毒株NT0801(LP)，NT0801第70代衍生毒株NT0801-F70(LP-der)和D

7、MEM營養(yǎng)液（對照），隔離飼養(yǎng)觀察。攻毒后0、6、9、15天用ELISA方法檢測豬血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10含量;攻毒后15天用Real-timePCR方法檢測各組肺臟和腦組織中TLR2、3、7和8基因表達水平，并分離豬肺泡巨噬細胞（PAMs）和豬外周血淋巴細胞(PBMCs)，分別采用TLR2、3、7\8的配體(LTA、poly(I∶C)、CL097)和PRRSV刺激，檢測細胞上清中細胞因子水平。結果

8、為:與LP相比，HP組試驗豬產生明顯臨床癥狀，而LP-der幾乎沒有毒力;HP感染豬的血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平高于LP或者LP-der組。LP組PAMs經poly(I∶C)或CL097刺激后分泌的TNF-α和IL-1β水平顯著高于DMEM營養(yǎng)液對照組，同時，HP組PBMCs經CL097刺激后分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6顯著高于LP和LP-der組。HP組PBMCs經CL097刺激后分泌的TNF-

9、α、IL-1β、IL-6高于LP和LP-der組，LP組PAMs經poly(I∶C)、CL097刺激后TNF-α和IL-1β的分泌高于DMEM組。該結果表明，與LP和LP-der相比，HP更能誘導TLR3、7、8和TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ表達，從而豐富了PRRSV免疫和致病機制理論，并有助于開發(fā)更為有效的PRRSV疫苗。
　　4.豬Toll樣受體配體對PRRSV免疫佐劑作用
　　采用PRRSV滅活病毒液(

10、KV)與TLR配體組合后皮下免疫小鼠。結果表明，單獨的poly(I∶C)和CL097誘導小鼠IFN-γ和PRRSV特異性抗體水平高于KV組或KV-LTA組。進而，將PRRSV滅活病毒液與poly(I∶C)或CL097混合后免疫仔豬，檢測其免疫保護效應。結果為，KV混合poly(I∶C)或CL097后誘導豬體產生的PRRSV特異性抗體和T淋巴細胞增殖水平高于KV組。攻毒后，與KV或對照組相比，KV-poly(I∶C)或-CL097免疫組患

11、豬產生的臨床癥狀較輕、病毒血癥更低、肺部的病理損傷更少。表明KV-poly(I∶C)或-CL097能提高抵抗PRRSV的保護力。TLR3和TLR7/8的配體為新PRRSV疫苗的開發(fā)提供了候選佐劑。
　　5.豬IFIT3重組腺病毒的構建與鑒定
　　使用RT-PCR方法從豬肺泡巨噬細胞中擴增出豬的IFIT3基因，成功構建穿梭載體pShuttle-CMV-IFIT3，經PCR、測序鑒定正確。將穿梭載體經PmeⅠ線性化后，在大腸桿菌

12、BJ5183內與腺病毒骨架載體pAdEasy-1進行同源重組，產生重組腺病毒基因組DNA。將重組腺病毒DNA經PacⅠ酶切后線性化后通過脂質體方法轉染HEK-293A細胞，在細胞內組裝成完整的腺病毒。通過RT-PCR、間接免疫熒光試驗(IFA)和Westem-blotting檢測到IFIT3的表達，證實重組腺病毒rAd-IFIT3可以正確表達目的蛋白，從而為下一步抗病毒試驗打下基礎。
　　6.Poly(I∶C)通過IFIT3介導M

13、AVS信號通路抑制PRRSV復制
　　采用雙鏈RNA類似物poly(I∶C)作為刺激物，在MARC-145細胞上系統(tǒng)地觀察IFIT3在PRRSV復制過程中作用，結果顯示:雙鏈RNA類似物poly(I∶C)刺激MARC-145細胞可以抑制PRRSV復制，而IFIT3表達量明顯增加;過量表達豬IFIT3能顯著抑制PRRSV復制，干擾MARC-145細胞中內源性IFIT3的表達，利于PRRSV增殖，且同時破壞了poly(I∶C)介導的抗

14、病毒功能;過量表達豬IFIT3可以顯著增加poly(I∶C)誘導的IFN-β啟動子活性，相反，干擾MARC-145細胞中內源性IFIT3可以抑制poly(I∶C)誘導的IFN-β啟動子活性;Poly(I∶C)能激活MARC-145細胞中IFIT3、TBK1和磷酸化IRF3的表達。此外，盡管poly(I∶C)刺激的MARC-145中IFIT3與PRRSV核衣殼(N)蛋白在細胞漿中存在共定位現(xiàn)象，但是共沉淀結果表明二者之間無相互作用。本研究

15、結果表明，poly(I∶C)通過IFIT3介導MAVS信號通路抑制PRRSV復制，從而為PRRSV新型疫苗和抗病毒藥物研究奠定了基礎。
　　7.PRRSV不同非結構蛋白對豬TLR3啟動子活性影響
　　根據TLR3ORF基因序列設計兩條同向引物（GSP1和GSP2），利用4種限制性內切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ分別消化從PAMs提取的基因組DNA，消化產物與適配子鏈接產生4種消化的DNA庫（DL1、DL2、DL

16、3和DLA），并分別以此為模板，進行基因步移。用特異性引物GSP1與適配子引物AP1進行第1步PCR擴增，然后以第1步PCR產物為模板，用特異性引物GSP2與適配子引物AP2進行第2步PCR擴增。將獲得的特異性PCR產物克隆至pGL3-Basic質粒，獲得pGL3-TLR3-Luc重組質粒，基因序列測定結果證明該質粒含有的外源基因與TLR3啟動子基因序列一致。將pGL3-TLR3-Luc質粒轉染MARC-145細胞中經poly(I∶C)