毒死蜱和汞離子核酸適體的篩選、改造及檢測方法的研究.pdf

1、農(nóng)藥殘留和重金屬污染是破壞自然和生態(tài)環(huán)境、危害人類健康的重要因素，而有效的檢測方法是控制有害物質(zhì)擴(kuò)大污染的前提和基礎(chǔ)。當(dāng)前農(nóng)藥如毒死蜱的檢測方法主要是高效液相色譜法、氣相色譜法、色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析方法，重金屬如汞離子的檢測方法主要是原子吸收光譜法、原子熒光光譜法等。這些傳統(tǒng)的儀器方法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但都具有儀器昂貴、樣品處理過程復(fù)雜繁瑣等弊端。因此需要進(jìn)一步發(fā)展新的檢測有毒有害物質(zhì)的方法。
　　 近年發(fā)展的核酸適

2、體可以借助氫鍵、靜電作用、范德華力等分子間作用力形成特殊的二級結(jié)構(gòu)，從而特異地識別靶分子。核酸適體具有靶分子范圍廣、親和力強(qiáng)、特異性高、制備、修飾方便快速等生化特性，因此以適體為材料建立有害物質(zhì)的檢測方法成為新的趨勢。
　　 本文分別以毒死蜱和汞離子為靶分子，研究其與核酸適體的作用，建立相應(yīng)的檢測方法。主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.毒死蜱DNA核酸適體的篩選、鑒定及結(jié)構(gòu)分析利用SELEX技術(shù)（Systematic Ev

3、olution of Ligands by Exponential Enrichment），以鏈親和素修飾的凝膠為載體，從合成的長度為91個(gè)堿基含有30個(gè)隨機(jī)序列的單鏈DNA(ssDNA)文庫中，篩選獲得識別毒死蜱的適體，并利用熒光標(biāo)記法對其進(jìn)行了活性分析，測定了適體的篩選效率、親和力及特異性。結(jié)果表明:經(jīng)過15輪篩選，DNA文庫的篩選效率達(dá)到44.00％，最終獲得9條適體，其中適體N23對毒死蜱具有最高的親和力，并比較分析了N23對水

4、胺硫磷、丙溴磷、氧樂果的結(jié)合活性，利用DNAMAN分析軟件，對4個(gè)親和力較高的適體進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及結(jié)合位點(diǎn)分析，得出TTCTT、ATAT和GCGC環(huán)可能是其活性結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。
　　 2.毒死蜱核酸適體的改造和檢測方法的研究為了提高毒死蜱適體的親和力，以TTCTT、ATAT和GCGC環(huán)為結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行DNA拼接、組裝獲得3條寡核苷酸，即M1、M2、M3，通過三化合物熒光分析法，鑒定改造后適體的結(jié)合活性。結(jié)果表明:與N23相比，M3對毒

5、死蜱的結(jié)合能力提高，以M1為材料建立毒死蜱的熒光檢測方法，在0.0625-0.5 mmol/L范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度變化值與毒死蜱濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9942，檢出限為0.0625 mmol/L。
　　 3.鎳離子RNA適體的改造及具有結(jié)構(gòu)活性的汞離子適體的獲得目前金屬離子的核酸適體多為RNA，而RNA在環(huán)境中不穩(wěn)定，極其容易降解，因此尚未出現(xiàn)以RNA為材料建立的金屬離子檢測體系。為了擴(kuò)大金屬離子適體的應(yīng)用范圍，將RNA適體

6、改造為穩(wěn)定且有活性的DNA適體則成為一個(gè)新思路。對鎳離子的RNA核酸適體的堿基序列進(jìn)行替換、剪切后獲得兩條DNA寡核苷酸序列DNA1-B和N1。通過熒光法鑒定得出DNA1-B對鎳離子有一定的結(jié)合能力，而N1對汞離子有較強(qiáng)的特異性結(jié)合作用，且汞離子濃度范圍為1.25-20 ppm(mg/kg)時(shí)，N1熒光猝滅體系熒光強(qiáng)度變化值與Hg2+濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9993，檢出限為0.625 ppm。
　　 4.汞離子核酸適體改

7、造及檢測方法的建立基于汞離子能夠與N1特殊的二級結(jié)構(gòu)及堿基T特異性相結(jié)合的雙重原理，對N1進(jìn)行了堿基替換、剪切等改造，獲得了4條DNA寡核苷酸序列，即N4、N5、N6和N7。利用熒光分析法對四條適體進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明:相對N1，四條適體對汞離子的識別活性均有所提高，其中適體N5與汞離子結(jié)合活性最為靈敏，特異性高，線性范圍為0.156-2.5 ppm，最低檢出限為78 ppb。對環(huán)境中水樣品進(jìn)行汞離子加標(biāo)檢測，結(jié)果較好，回收率為85％-9