基因組重排在產纖維素酶斜臥青霉菌種改造中的應用.pdf

1、隨著資源短缺、環(huán)境污染和能源危機的加劇，尋找和開發(fā)可以代替化石能源的新能源就成了亟待解決的問題。纖維素是地球上分布最廣、含量最豐富的可再生資源，纖維素酶可以將可再生的木質纖維素轉化為可發(fā)酵的多糖、單糖等混合糖漿，進一步發(fā)酵生產為乙醇等清潔能源物質或者其它高值生物化學產品。在第二代生物乙醇工業(yè)或中，其中纖維素酶的成本，是纖維素乙醇商品化的一個重要制約因素。
　　 斜臥青霉JU-A10是我們實驗室由斜臥青霉114-2通過多輪誘變得到

2、的抗阻遏突變株，其本身除了纖維素酶外也可以產生大量的半纖維素酶，對降解結構復雜的木質纖維素有很好的應用前景。但是其纖維素酶生產能力仍不能滿足工業(yè)要求。而目前，我們對斜臥青霉的遺傳背景和纖維素酶合成機制不夠清楚，也沒有合適的遺傳改造工具，所以通過理性設計改造菌株在操作上有一定的難度。本文通過近幾年發(fā)展起來并廣泛應用的基因組重排技術對其進行改造，主要獲得了以下結果：
　　 1、建立了高效的纖維素雙層平板篩選方法
　　 優(yōu)化了

3、雙層平板中培養(yǎng)基的組成，確定了使用球磨微晶纖維素和葡萄糖作為篩選纖維素酶高產突變株的選擇壓力，建立了水解圈大小和纖維素酶活正相關的高效的纖維素雙層平板篩選方法。JU-A10只可以在2％球磨微晶纖維素和低于1％葡萄糖的雙層平板上產生纖維素水解圈，所以在篩選過程中，逐步提高纖維素和葡萄糖的濃度可進一步篩選到纖維素降解能力更強或是抗阻遏能力更高的突變株。
　　 2、建立了斜臥青霉原生質體制備、再生和雙親滅活原生質體融合方法
　　

4、 建立了高效的斜臥青霉原生質體制備和再生的方法：在優(yōu)化后的菌絲培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌絲24 h后，經2 mg ml-1溶壁酶、4 mg ml-1纖維素酶、4 mg ml-1蝸牛酶三種酶酶解菌絲后，得到的原生質體經純化后，原生質體的再生比率可達90％以上。
　　 建立了雙親本滅活原生質體融合方法：原生質體在紫外照射30 min或50℃熱滅活50 min后，失去再生能力。將這兩種方法滅活后的原生質體混合在一起，于35％PEG、10 mM

5、Ca2+、35℃的條件下進行融合。經這兩種不同滅活方法處理過的原生質體，會在融合過程中通過互補，再生出融合子。
　　 3、通過基因組重排技術得到了纖維素酶活和產量顯著提高的融合子
　　 使用紫外-EMS復合誘變和N+離子注入誘變兩種方法，經過纖維素雙層平板初篩和搖瓶復篩，得到了4株相對于出發(fā)株JU-A10各有優(yōu)勢的突變株，滿足了基因組重排所要求的初始親本庫的多樣性。然后，我們以這四株突變株作為第一輪基因組重排的親本，進行

6、重排操作，在篩選平板SM2(2％纖維素、2％葡萄糖)上挑選能夠快速產生水解圈的突變株，通過復篩后得到6株酶活進一步提高的融合子。以此這6株菌作為第二輪基因組重排的親本，通過在篩選平板SM3(5％纖維素、2％葡萄糖)的初篩和搖瓶復篩，最終獲得3株纖維素酶顯著提高的融合子：GS2-15、GS2-21、GS2-22，它們可以在復篩培養(yǎng)基中產生相當于JU-A10200％、209％、194％的纖維素酶活。
　　 4研究并分析了融合子GS2

7、-15、GS2-21、GS2-22與出發(fā)株JU-A10差異
　　 通過對融合子和出發(fā)株進行了固體平板培養(yǎng)時菌落、孢子、液體培養(yǎng)時菌絲的形態(tài)學觀察，結果表明：與出發(fā)株相比，融合子的菌落變小，孢子體積變大，孢子壁變?。辉谝后w培養(yǎng)時菌絲變細，在培養(yǎng)后期菌絲更易斷裂成小段，初步推測其在液體培養(yǎng)時形態(tài)學的變化，有利于纖維素酶的大量分泌。
　　 通過優(yōu)化隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)反應體系和程序，建立了斜臥青霉RAPD反應體系，

8、對3個融合子和JU-A10的RAPD指紋圖譜進行了分析。3個融合子大部分RAPD條帶與JU-A10相同，但是它們之間及它們和JU-A10之間也出現(xiàn)了一些特異性條帶。通過遺傳相似系數(shù)的計算和聚類分析，融合子和出發(fā)株以遺傳相似系數(shù)0.87為域閥值，分為三類：第一類群由出發(fā)株JU-A10和融合子GS2-22組成；第二類群、第三類群分別為GS2-15和GS2-21。這反映出融合子在分子水平上發(fā)生了變異。
　　 特別研究了融合子和出發(fā)株在

9、以木糖渣為碳源時的胞外和胞內纖維素酶活、蛋白濃度和生物量等特征，結果表明：融合子生長旺盛，并且生物量略高于出發(fā)株，其蛋白濃度和纖維素酶活也明顯高于出發(fā)株；同時發(fā)現(xiàn)融合子的胞內纖維素酶在發(fā)酵初期就大量合成。推測融合子的纖維素酶活提高可能是由于生長旺盛，更早的纖維素酶合成和更高的蛋白分泌能力等因素綜合作用所致。
　　 此外，在阻遏條件下(2％葡萄糖為唯一碳源)，融合子比出發(fā)株表現(xiàn)更優(yōu)越。融合子基本上一天就可以耗盡葡萄糖，并且生物量和

10、纖維素酶活高于出發(fā)株。分析和比較了基因組重排后融合子和出發(fā)株的胞外蛋白SDS-PAGE和內切酶活性電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)不論是在誘導還是阻遏情況下，融合子的胞外蛋白與出發(fā)株大體相似，但是有個別蛋白條帶的增減，某些內切酶活性條帶表達增強。這些蛋白表達的差異反映了融合子在蛋白水平發(fā)生了變化。
　　 5、研究了融合子利用木質纖維素為碳源及5-L發(fā)酵罐產酶情況
　　 以木質纖維素玉米秸粉、麥秸粉、甘蔗渣作為底物，研究了基因組重排后融合子

11、和出發(fā)株的產酶情況，發(fā)現(xiàn)融合子在較短的時間內就可以產生大量的酶，并且其纖維素酶活和木聚糖酶活與出發(fā)株相比都有顯著提高。
　　 進行5-L發(fā)酵罐實驗時，融合子的纖維素酶合成更快，并且酶活進一步提高，但是在后期pH會上升到中性從而導致酶活迅速下降，不利于實際生產。為解決此問題，我們以融合子GS2-15為實驗菌株優(yōu)化了500 ml搖瓶中緩沖劑的種類和劑量，其中以0.08％CaCO3作為緩沖劑成本最低，效果最好。通過進行5-L發(fā)酵罐的驗

12、證實驗，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液pH和酶活在整個發(fā)酵中后期保持穩(wěn)定，濾紙酶活可以達到15.04 FPU ml-1，達到國際先進水平；胞外蛋白濃度達到5.81 mg ml-1；纖維素內切酶最高為133.12 IU ml-1；β-葡萄糖苷酶酶活最高為5.18 IU ml-1；木聚糖酶酶活最高為411.34IU ml-1。
　　 6、β-葡萄糖苷酶高產菌株斜臥青霉Peni-1的β-葡萄糖苷酶基因的克隆，酶的純化和酶學性質研究
　　 Peni

13、-1是本實驗室篩選到的一株β-葡萄糖苷酶高產的斜臥青霉菌株。我們克隆了Peni-1的β-葡萄糖苷酶的基因，基因含有5個內含子，基因編碼區(qū)全長2586，編碼861個氨基酸，與GS2-15相比有三個氨基酸序列的差異，分別是第2位的Lys→Arg，482位的Gly→Ser，489位的Val→Ile。純化了Peni-1的β-葡萄糖苷酶，并研究了其酶學性質，其最適反應溫度為70℃；在60℃保溫12 h后，酶活能保留80％以上；最適作用pH為5；比

14、活為129.6 IU mg-1；以水楊素為底物時Km值為2.6 mmol L-1；以pNPG為底物時Km值為0.2mmol L-1。與GS2-15的胞外蛋白SDS-PAGE相比，Peni-1有些蛋白條帶消失，有些蛋白條帶表達加強。Peni-1的β-葡萄糖苷酶本身性質變化不大，所以我們推測Peni-1可能是由于β-葡萄糖苷酶合成調控機制發(fā)生了變化，導致可以分泌表達大量的β-葡萄糖苷酶蛋白。
　　 7、斜臥青霉濾紙酶活與β-葡萄糖苷