適用于大樣本高分辨三維成像的樹脂塊連續(xù)薄切片研究.pdf

1、近來興起的腦神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究,需要能夠在哺乳動物全腦范圍實現(xiàn)神經(jīng)突起甚至突觸分辨率水平的解剖結(jié)構(gòu)成像的技術(shù)。根據(jù)這一需求,已發(fā)展出許多新的成像方法和成像系統(tǒng)?；跇渲窈捅∏衅娘@微成像技術(shù),被認(rèn)為是目前最可能實現(xiàn)全腦精細(xì)神經(jīng)連接結(jié)構(gòu)獲取的方法之一。當(dāng)這類技術(shù)應(yīng)用于小鼠全腦這種厘米尺寸大樣本時,薄切片的加工性能和穩(wěn)定性對海量地長時間微米分辨率獲取神經(jīng)精細(xì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的質(zhì)量具有至關(guān)重要的影響。然而目前還缺少對連續(xù)薄切片尤其是大樣本的

2、連續(xù)薄切片的系統(tǒng)性的研究。
　　顯微光學(xué)切片斷層成像(Micro-opticalSectioningTomography,MOST)技術(shù)是基于樹脂包埋和薄切片的顯微成像技術(shù)的一個代表,主要致力于研究各種染色的小鼠全腦的高分辨率成像。MOST技術(shù)通過對小鼠全腦組織用樹脂包埋后進(jìn)行厚度為0.5-1μm的連續(xù)自動薄切片和成像,實現(xiàn)海量數(shù)據(jù)獲取。本文以MOST系統(tǒng)為實驗平臺,建立用于大樣本三維高分辨成像的樹脂連續(xù)薄切片性能的定量評估和研究

3、方法,并以Spurr樹脂為代表的環(huán)氧類樹脂樣本為對象,研究MOST系統(tǒng)微米切片性能。
　　由于大樣本薄切片的直接測量實施的難度大,可靠性低,故提出了基于加工表面形貌測量的性能評估的基本思想,并闡述了該方法的總體方案、技術(shù)選擇、以及評估和優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)。
　　表面波紋度、表面粗糙度、切片厚度與切片圖像質(zhì)量和三維重建準(zhǔn)確性直接相關(guān)。通過表面波紋曲線、三維形貌和臺階高度的獲取與測量對這三項基本性能進(jìn)行研究。MOST系統(tǒng)的具體實驗研究表

4、明,MOST系統(tǒng)微米切片Spurr樹脂應(yīng)避免使用會造成振動和表面波紋加強的F300切片速度,并保證樣本的邵氏硬度在80以上,由此可在非切片邊界處獲得Rq低于20nm、Rz低于200nm的高質(zhì)量表面;通過刀刃滾動角的調(diào)節(jié),微米切片的厚度變動范圍可以控制在10％以內(nèi)。
　　大樣本的薄切片會經(jīng)歷同一斷面分解為多條切片的過程,帶來切片條帶的橫向配準(zhǔn)和邊界損失問題,并可能直接影響三維圖像數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性。首次提出基于表面鋸齒高度的刀刃滾

5、動角測量方法,并以此評估條帶的橫向配準(zhǔn)程度。利用掃描電子顯微鏡研究條帶邊界的損失,以邊界缺口寬度評價邊界損失。MOST系統(tǒng)微米切片Spurr樹脂實驗說明:加工表面鋸齒高度越大,橫向條帶錯位和邊界缺口寬度越大;較軟的樣本更易產(chǎn)生面積較大的邊界缺口。通過調(diào)整刀刃滾動角將加工表面鋸齒高度控制在200-300nm,并盡量采用較硬的樣本(推薦1＃邵氏硬度,約83.5度),可將橫向切片配準(zhǔn)偏差控制在20%~30%,邊界缺口寬度控制在MOST成像橫向

6、分辨率(0.71μm)以下。結(jié)合微米臺階高度和鋸齒高度的測量,精確計算了MOST微米切片Spurr樹脂的實際平均切片厚度,與設(shè)定值1μm的偏差不超過3%。
　　大樣本薄切片的實施必須在水中進(jìn)行,水會使得樹脂材料膨脹甚至軟化,對切片性能可能會有影響。針對水環(huán)境下切片性能進(jìn)行研究和優(yōu)化,首次提出了基于表面臺階高度測量的樣本表面短時間浸水膨脹程度的定量研究方法,并用于Spurr樹脂塊的吸濕性膨脹特性研究。根據(jù)Spurr樹脂吸濕性膨脹特性

7、,應(yīng)保證同一層斷面中各切片條帶的浸水時間一致且盡可能短,一般控制在4分鐘以內(nèi),浸水時間超過8分鐘,可能引起加工表面力學(xué)性能退化從而造成嚴(yán)重數(shù)據(jù)損失。利用邵氏硬度測量對Spurr樹脂浸水后硬度的變化進(jìn)行研究,認(rèn)為25℃的水溫和不低于1mm/24h的表面更新速度,基本可以避免水環(huán)境降低Spurr樹脂切片性能。
　　本文實驗研究獲得一系列優(yōu)化切片性能的條件參數(shù),并表明MOST系統(tǒng)運行在可選參數(shù)條件下,能實現(xiàn)高精度和長時間穩(wěn)定的微米切片工