苯甲酸鈉與糖精鈉、檸檬黃體外聯(lián)合毒性的研究.pdf

1、目的：采用L929和PC12細(xì)胞株，以通常在食品中同時(shí)存在的苯甲酸鈉、糖精鈉和檸檬黃為受試物，進(jìn)行單獨(dú)和聯(lián)合作用對(duì)體外細(xì)胞的直接毒性、DNA損傷和神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制的研究，初步探索多種食品添加劑同時(shí)使用的安全性。
　　 方法：(1)采用MTT試驗(yàn)方法及效應(yīng)相加模型聯(lián)合染毒方案檢測(cè)受試物對(duì)細(xì)胞增殖的毒性作用；(2)采用乳酸脫氫酶試劑盒及2×2析因設(shè)計(jì)方差分析檢測(cè)受試物對(duì)細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響；(3)采用ELISA試劑

2、盒及2×2析因設(shè)計(jì)方差分析檢測(cè)受試物對(duì)細(xì)胞中8-OHdG含量的影響；(4)采用單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)及2×3析因設(shè)計(jì)方差分析檢測(cè)細(xì)胞DNA斷裂損傷；(5)采用KCl-SDS沉淀法及2×2析因設(shè)計(jì)方差分析檢測(cè)受試物對(duì)細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)效應(yīng)(DPC)；(6)采用神經(jīng)突長(zhǎng)度測(cè)量法及效應(yīng)相加模型設(shè)計(jì)檢測(cè)受試物對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。
　　 結(jié)果：(1)細(xì)胞直接毒性。各受試物單獨(dú)對(duì)L929細(xì)胞增殖均有抑制作用，并存在劑

3、量—效應(yīng)應(yīng)關(guān)系。其中苯甲酸鈉、糖精鈉和檸檬黃的IC50分別為6.47±0.07，19.50±0.37和33.09±0.81g/L。苯甲酸鈉+糖精鈉、苯甲酸鈉+檸檬黃對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)為相加作用(P＞0.05)。苯甲酸鈉(6，10g/L)、糖精鈉(6，20，34g/L)和檸檬黃(34，58g/L)引起細(xì)胞培養(yǎng)上清液的LDH活性明顯升高(P＜0.05)，并有劑量—效應(yīng)應(yīng)關(guān)系。苯甲酸鈉+糖精鈉、苯甲酸鈉+檸檬黃對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞上清液LDH活性影響

4、為相加作用(P＞0.05)。(2)DNA損傷。除了檸檬黃在12.00g/L引起細(xì)胞內(nèi)8-OHdG含量較空白對(duì)照組增加(P＜0.05)，三種受試物各劑量組單獨(dú)，以及苯甲酸鈉+糖精鈉、苯甲酸鈉+檸檬黃對(duì)L929細(xì)胞內(nèi)8-OHdG含量沒有影響(P＞0.05)。在SCGE試驗(yàn)中，苯甲酸鈉、糖精鈉和檸檬黃單獨(dú)作用都引起L929細(xì)胞DNA斷裂損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞DNA拖尾的數(shù)量、DNA尾長(zhǎng)、尾/頭長(zhǎng)比、尾％DNA較空白對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)，并

5、有劑量——反應(yīng)關(guān)系。檸檬黃、苯甲酸鈉和糖精鈉在DNA損傷強(qiáng)度上，引起細(xì)胞DNA拖尾率顯著增加的最低劑量分別為0.06，0.50和5g/L。苯甲酸鈉+糖精鈉對(duì)細(xì)胞DNA斷裂損傷的各項(xiàng)指標(biāo)的影響沒有協(xié)同作用(P＞0.05)，而苯甲酸鈉+檸檬黃對(duì)反映細(xì)胞DNA斷裂損傷的各項(xiàng)指標(biāo)影響表現(xiàn)為拮抗作用(P＜0.05)。苯甲酸鈉、糖精鈉、檸檬黃分別從3，20和58g/L的劑量開始引起L929細(xì)胞DPC系數(shù)顯著增高(P＜0.01)。苯甲酸鈉+糖精鈉對(duì)D

6、PC系數(shù)影響表現(xiàn)為相加作用(P＞0.05)，而苯甲酸鈉+檸檬黃表現(xiàn)為協(xié)同作用(P＜0.05)。(3)神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制。檸檬黃、糖精鈉和苯甲酸鈉對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)的IC50分別為0.96±0.25，3.20±1.30和4.27±0.46g/L，抑制作用有明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。苯甲酸鈉+糖精鈉對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制作用為相加作用(P＞0.05)；苯甲酸鈉+檸檬黃在兩者50％IC20-25的劑量聯(lián)合作用時(shí)對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制

7、率為44.56±0.90％，與真實(shí)期望抑制率(25.55±2.51％)比較差別有顯著性(P＜0.05)，表現(xiàn)為協(xié)同作用。
　　 結(jié)論：苯甲酸鈉、糖精鈉和檸檬黃能抑制細(xì)胞增殖、使細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性增加，表明受試物有細(xì)胞膜直接毒性，可能通過改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性和通透性而影響細(xì)胞成活與增殖。苯甲酸鈉+糖精鈉、苯甲酸鈉+檸檬黃對(duì)細(xì)胞增殖抑制和對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性改變均無(wú)協(xié)同作用。三種受試物能抑制PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)，以

8、檸檬黃的作用最強(qiáng)。苯甲酸鈉+糖精鈉對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制沒有協(xié)同作用，而苯甲酸鈉+檸檬黃則具有協(xié)同作用。這種效應(yīng)可能與某些食品添加劑影響兒童的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和改變行為有關(guān)。三種受試物單獨(dú)及聯(lián)合作用雖有沒有氧化性損傷作用，但都能引起DNA的斷裂損傷和DPC增加。苯甲酸鈉+檸檬黃對(duì)細(xì)胞DNA斷裂損傷沒有協(xié)同作用，苯甲酸鈉+檸檬黃對(duì)DNA斷裂損傷表現(xiàn)為拮抗作用，可能與DPC形成掩蓋了DNA斷裂損害的表現(xiàn)有關(guān)。在DPC效應(yīng)上，苯甲酸鈉+糖精