重組牛凝血酶原-2包涵體的體外重折疊復性研究.pdf

1、凝血酶是目前應用最為廣泛的一種止血劑,在臨床上有非常重要的用途。凝血酶原-2(pThr-2)是α-凝血酶生成過程中的分子量最小的單鏈中間前體,經(jīng)激活后可轉(zhuǎn)化為有活性的α-凝血酶。本論文通過將含凝血酶原-2基因的質(zhì)粒克隆至大腸桿菌中并得到大量表達,但這樣獲得的凝血酶原為包涵體形式,必須經(jīng)過體外復性后,再激活為凝血酶。本文在優(yōu)化發(fā)酵條件獲得高產(chǎn)量的重組牛凝血酶原-2包涵體的基礎上,對牛凝血酶原-2的體外重折疊復性如稀釋復性以及溫敏型聚N-異

2、丙基丙烯酰胺(PNIPA)凝膠和二硫鍵異構酶(DsbA)介導的復性進行了詳細的研究。將攜帶已克隆pThr-2基因的質(zhì)粒成功地轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導后繼續(xù)培養(yǎng),獲得凝血酶原-2包涵體。對培養(yǎng)基組成及操作條件進行了優(yōu)化,詳細考察了碳源、氮源、無機鹽、誘導起始時間、誘導劑添加量、接種量、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速等因素對目標蛋白表達量的影響。最終在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下,重組凝血酶原-2包涵體的產(chǎn)量為110 mg/L發(fā)酵液,占菌體總

3、蛋白的21.7％。將收集的菌體用超聲波破碎后,離心得到pThr-2包涵體,然后Tris-HCl緩沖液洗滌包涵體,并優(yōu)化了洗滌液組成。包涵體用8 M尿素(含0.3 MDTT)溶解后,在單因素實驗的基礎上,采用一次回歸正交試驗及快速登高試驗,綜合考察了pThr-2包涵體稀釋復性過程的關鍵參數(shù),包括GSSG濃度、GSSG/GSH比例、尿素濃度、PEG6000濃度、L-Arg添加量以及復性溫度等。凝血酶活力用生色底物法測定,結果在優(yōu)化條件下凝血

4、酶活力可達2948U/mL。在稀釋復性的基礎上,進一步考察了添加溫敏型PNIPA凝膠和DsbA協(xié)助凝血酶原-2體外復性的效果。實驗結果表明,加入凝膠協(xié)助復性后凝血酶活力可達6222 U/mL,凝膠的最佳添加量為105 mg/mL,且復性初始蛋白濃度越高,凝膠協(xié)助復性的效果就越明顯;但PNIPA凝膠的加入在協(xié)助復性的同時,也在一定程度上延長了復性達到平衡所需的時間。我們將含有DsbA基因的pAVD63質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,并在優(yōu)化的培養(yǎng)條