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文檔簡(jiǎn)介
1、凝血酶原是在肝臟中合成的血清凝血因子,也是凝血酶的前體物。在凝血酶原前體的谷氨酸區(qū)有十個(gè)谷氨酸殘基,當(dāng)有足夠的維生素K存在時(shí),這些谷氨酸殘基將全部轉(zhuǎn)化成γ-羧基谷氨酸而成為正常凝血酶原。當(dāng)維生素K不足或存在維生素K拮抗劑時(shí),這些谷氨酸未被全部羧化而稱為脫-γ-羧基凝血酶原(DCP)。由于γ-羧基谷氨酸中的羧基是與鈣結(jié)合的一個(gè)功能區(qū),它的缺乏失去了與鈣結(jié)合的基礎(chǔ),故DCP無凝血酶原的功能。
DCP作為肝癌標(biāo)志物已用于臨床診斷
2、中。研究DCP的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn),其中有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)相似,這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為能促進(jìn)成熟肝細(xì)胞的有絲分裂。DCP在血清和組織中的表達(dá)與肝癌的惡化程度及血管侵襲程度密切相關(guān)。在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)DCP能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)的增殖與轉(zhuǎn)移。本課題主要研究DCP對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的影響及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路。
試驗(yàn)方法:
DCP促進(jìn)肝癌增殖、轉(zhuǎn)移機(jī)制研究:選用人肝癌細(xì)胞株HLE及
3、SK-Hep,兩種細(xì)胞株均不產(chǎn)生DCP。CCK-8法檢測(cè)DCP對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響;AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡率;Transwell chamber法檢測(cè)DCP對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲的影響;明膠酶譜法(Gelatinzymography)檢測(cè)DCP對(duì)肝癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活力的影響;Western blot法檢測(cè)DCP對(duì)肝癌細(xì)胞MMPs、p-Met、EGFR、p-EGFR、p-ERK1/2、p-MEK1/2和p-c
4、-Raf表達(dá)水平的影響;進(jìn)一步試驗(yàn)采用PD98059阻斷ERK1/2MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路,Western blot法檢測(cè)DCP對(duì)肝癌細(xì)胞生成MMPs的影響。ELISA法和Western-blot法檢測(cè)DCP對(duì)肝癌細(xì)胞生成促血管生成因子的影響。
維生素K2(VitK2)對(duì)肝癌增殖和侵襲作用研究:選用人肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5和HepG2,Western blot法檢測(cè)維生素K2對(duì)肝癌細(xì)胞生成DCP的影響,MTT法檢測(cè)維生
5、素K2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響;Transwell chamber法檢測(cè)維生素K2對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲的影響。
試驗(yàn)結(jié)果:
DCP促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲并激活ERK1/2MAPK細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路:CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DCP能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞HLE和SK-Hep的增殖,與正常凝血酶原對(duì)照組比較有顯著性差異。160ng/ml濃度DCP孵育48h,HLE細(xì)胞增殖最高達(dá)到51.2%;AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DCP
6、能夠?qū)筫rlotinib誘導(dǎo)的HLE細(xì)胞凋亡;明膠酶譜法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DCP能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞HLE和SK-Hep生成的MMPs活力,同時(shí)Transwell chamber法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DCP能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞穿過人工基底膜;Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DCP能夠提高肝癌細(xì)胞MMPs、p-Met、p-EGFR、EGFR、p-ERK1/2、p-MEK1/2和p-c-Raf的表達(dá)水平;同時(shí)ERK1/2MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路特異性阻斷劑-PD9805
7、9能夠抑制DCP誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HLE和SK-Hep表達(dá)MMPs,50μM的PD98059即有明顯抑制作用,80μM的PD98059幾乎完全抑制了MMPs的表達(dá)。提示DCP誘導(dǎo)MMPs表達(dá)作用與ERK1/2MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。ELISA法和Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DCP能夠促進(jìn)血管生成因子VEGF,TGF-α和bFGF的表達(dá)。
維生素K2抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲:Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VitK2能夠抑
8、制肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5和HepG2生成DCP,同時(shí)抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力;當(dāng)VitK2濃度到40μM,孵育120h,對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞的增殖抑制率最高達(dá)到48.2%,在HepG2細(xì)胞也觀察到相似的抑制作用;2-40μM的VitK2能夠明顯抑制PLC/PRF/5細(xì)胞的侵襲能力,最高抑制率達(dá)到72.4%。
結(jié)論:
DCP能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲,其機(jī)制與DCP促進(jìn)肝癌細(xì)胞生成MMPs有關(guān)。通
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