Fgl2凝血酶原酶基因在肝癌血管新生中的作用.pdf

1、目的：據(jù)統(tǒng)計，原發(fā)性肝癌在我國已成為第二位惡性腫瘤殺手，目前針對肝癌的治療措施主要是采取早期手術(shù)切除、晚期化療，同時輔以放療和注射免疫制劑等傳統(tǒng)方案。盡管臨床上傳統(tǒng)的治療方案能緩解早期患者的病情，但因毒副作用大，故對中晚期及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)患者療效較差。近年來發(fā)現(xiàn)的人纖維介素(hfgl2)，屬于纖維蛋白原家族成員，主要表達于活化的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，具有絲氨酸蛋白酶活性，能直接裂解凝血酶原成為凝血酶，而凝血酶被認(rèn)為是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等病

2、理生理改變的重要環(huán)節(jié)之一。本研究通過干擾高侵襲人肝癌細(xì)胞系HCCLM6 hfgl2基因表達，并以裸鼠角膜血管新生模型為技術(shù)平臺，探討fgl2凝血酶原酶基因?qū)θ祟惛伟┘?xì)胞株HCCLM6裸鼠角膜移植瘤血管新生的影響，同時檢測fgl2凝血酶原酶在人類肝癌細(xì)胞株HCCLM6裸鼠皮下移植瘤中表達的細(xì)胞類型，為揭示fgl2在肝癌發(fā)生和發(fā)展中的作用提供依據(jù)，并為肝癌的基因治療提供新的靶點。
　　 方法：將成功構(gòu)建的fgl2凝血酶原酶基因干擾質(zhì)

3、粒pcDNA6.2-fgl2-miRNA轉(zhuǎn)染高侵襲人肝癌細(xì)胞系HCCLM6，經(jīng)8周BSD抗生素篩選后獲得fgl2基因沉寂的穩(wěn)定細(xì)胞系HCCLM6-fgl2(-)；應(yīng)用RT-PCR和Western Blotting檢測高侵襲人肝癌細(xì)胞系HCCLM6與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HCCLM6-fgl2(-)中fgl2的mRNA及蛋白質(zhì)表達水平的差異；分別用人肝癌細(xì)胞株HCCLM6和HCCLM6-fgl2(-)建立裸鼠角膜血管新生模型，對比各組血管新生情況

4、；免疫組化雙染確定人類肝癌細(xì)胞株HCCLM6裸鼠皮下移植瘤中fgl2的表達細(xì)胞類型。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建fgl2基因沉寂的穩(wěn)定細(xì)胞系HCCLM6-fgl2(-)，熒光顯微鏡顯示HCCLM6-fgl2(-)細(xì)胞系純度達98[％]以上。PT-PCR結(jié)果顯示HCCLM6-fgl2(-)細(xì)胞系的fgl2基因被有效干擾。Western Blotting結(jié)果顯示HCCLM6-fgl2(-)較HCCLM6細(xì)胞fgl2 凝血酶原酶表達水平顯著

5、降低。在裸鼠角膜血管新生模型中，HCCLM6-fgl2(-)組較HCCLM6組角膜血管新生潛伏期延長1-2天、新生血管積分減少7-10分；免疫組化結(jié)果證實fgl2廣泛表達于裸鼠HCCLM6皮下移植瘤組織中的腫瘤實質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 結(jié)論：本研究證實fgl2凝血酶原酶基因干擾質(zhì)粒pcDNA6.2-fgl2-miRNA可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高侵襲人肝癌細(xì)胞系HCCLM6，且有效沉寂其fgl2基因和蛋白水平的表達。所建立的HCCL