新型凝乳酶產(chǎn)生菌Quambalaria cyanescens的鑒定及酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用研究.pdf

1、奶酪是原料奶用量最大的乳制品，凝乳酶作為奶酪生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵用酶，其主要生物學(xué)功能是有限剪切牛乳中K-酪蛋白的Phe105-Met106健，使牛奶發(fā)生凝結(jié)，被廣泛用于奶酪生產(chǎn)中，成為重要的酶制劑，其需求量約占金世界酶制劑生產(chǎn)總量的15％，成為第二大酶制劑。目前，全世界應(yīng)用最為廣泛的凝乳酶提取自小牛皺胃(第四胃)，自從人們開始加工干酪以來，就大量屠宰小牛以獲得凝乳酶，而可供屠宰的小牛數(shù)量逐年減少，從而導(dǎo)致世界范圍內(nèi)凝乳酶供應(yīng)相對(duì)缺乏，使凝

2、乳酶價(jià)格不斷上漲，迫使人們不得不尋找來源廣泛、價(jià)格低廉的新型凝乳酶。微生物具有生產(chǎn)周期短、易培養(yǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，利用微生物凝乳酶成為目前最有前途的發(fā)展方向，開發(fā)潛力大，因此本研究旨在篩選出凝乳酶高產(chǎn)菌株，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究，為凝乳酶的生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下：
　　 1從紅曲米中篩選到一株具有良好凝乳活性凝乳酶產(chǎn)生菌株QY229，通過形態(tài)特征及ITS-rRNA基因序列鑒定，確定其為Q.cyanescens。0.02

3、mM的特異性蛋白酶抑制劑Pepstatin A可使該菌發(fā)酵液失去凝乳活性，說明該菌所產(chǎn)凝乳酶為天冬氨酸類蛋白酶家族的一種。Shotgun(鳥槍法)蛋白鑒定結(jié)果中未見有與已報(bào)道的凝乳酶相關(guān)蛋白，說明Q.cyanescens產(chǎn)凝乳酶是一種新型蛋白。
　　 2通過DEAE Cellulose-52離子交換層析富集、Hiprep16/10 DEAE FF陰離子交換柱層析和Superdex7510/300 GL凝膠過濾層析，從發(fā)酵液中純化

4、了凝乳酶蛋白，在SDS-PAGE電泳上顯示單一條帶，純化倍數(shù)為24.1，回收率為19.1％。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶最適宜反應(yīng)溫度40℃，在30～40℃范圍內(nèi)可以保持較好的穩(wěn)定性，最適pH為5.0，pH4.5～6.5之間，能夠保持穩(wěn)定的活性，Ca2+、Mg2+、Zn2+和Fe2+對(duì)凝乳酶的凝乳活力有促進(jìn)作用，其中Ca2+對(duì)凝乳酶的凝乳活力的促進(jìn)作用最好，K+、Na+和Cu2+對(duì)凝乳活力有一定的抑制作用，Q.cyanescens凝乳酶和小牛

5、皺胃酶對(duì)乳酪蛋白的水解能力沒有顯著差異。
　　 3通過鏡下連續(xù)觀察培養(yǎng)確定了制備Q.cyanescens單孢子懸浮液的時(shí)間為6天，研究了不同劑量的紫外線與硫酸二乙酯對(duì)Q.cyanescens的致死率，繪制了致死率曲線，確定了紫外誘變Q.cyanescens單孢子懸浮液的時(shí)間為240S，硫酸二乙酯誘變Q。cyanescens單孢子懸浮液孢子的時(shí)間為40min。在此基礎(chǔ)上，以Q.cyanescens單孢子懸浮液為誘變對(duì)象，進(jìn)行了UV

6、、DES單因子誘變及先UV后DES、先DES后UV復(fù)合因子誘變，選育到一株凝乳酶產(chǎn)量較誘變初發(fā)菌株高105.16％的誘變菌株DU10。遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，該菌株表現(xiàn)出穩(wěn)定的遺傳性能。
　　 4對(duì)DU10菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化研究。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，基于Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基成分和起始pH、培養(yǎng)溫度、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間等12個(gè)影響產(chǎn)酶的相關(guān)因子進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明在PB設(shè)計(jì)的二水平范圍內(nèi)，

7、葡萄糖濃度和搖床轉(zhuǎn)速與酶活性呈正效應(yīng)(p<0.05)，起始pH對(duì)酶活性呈顯著的負(fù)效應(yīng)(p<0.05)，其它相關(guān)因素影響不顯著(p>0.05)。然后，基于Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)曲面優(yōu)化法對(duì)主要影響產(chǎn)酶因子的最佳水平及其交互作用進(jìn)行了進(jìn)一步研究，并建立了二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)預(yù)測(cè)模型，確定了菌株Q.cyanescens DU10產(chǎn)生凝乳酶的最佳發(fā)酵條件為：葡萄糖36g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏5g/L，氯化鈣0.5g/L，硫酸錳2.0mg

8、/L，吐溫-800.8g/L，起始pH4.6，裝液量50mL/250mL搖瓶，接種量1％(V/V)，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速188r/min，發(fā)酵時(shí)間96h。在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，菌株Q。cyanescens DU10產(chǎn)凝乳酶活性增加了2.5倍，凝乳活性達(dá)6.10 IMCU/mL。
　　 5將Q.cyanescens產(chǎn)凝乳酶在奶酪生產(chǎn)進(jìn)行了應(yīng)用研究。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了正交試驗(yàn)，獲得了Q.cyanescens產(chǎn)凝乳酶加工奶酪

9、的工藝參數(shù)組合為：凝乳酶添加量50 IMCU/L、CaCl2添加量0.02％、保溫時(shí)間40min、凝乳溫度35℃。利用TA-XT.PLUS/30食品物性測(cè)試儀對(duì)用凝乳酶制作的奶酪進(jìn)行TPA質(zhì)地剖面分析，結(jié)果表明Q.cyanescens凝乳酶生產(chǎn)的奶酪和小牛皺胃酶生產(chǎn)的奶酪在質(zhì)構(gòu)參數(shù)上沒有顯著差異；利用CVOR150流變儀對(duì)加入凝乳酶牛乳的動(dòng)態(tài)流變學(xué)參數(shù)進(jìn)行了表征，表明Q.cyanescens凝乳酶和小牛皺胃酶作用于牛乳的動(dòng)態(tài)流變參數(shù)沒有