納米聚合物刷介導的高性能免疫分析微陣列芯片研究.pdf

1、蛋白質(zhì)芯片起源于20世紀80年代，它是將大量蛋白質(zhì)規(guī)則地固定到某種基底表面形成微陣列，利用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用，實現(xiàn)大量目標蛋白并行分析的一項高新技術(shù)。蛋白質(zhì)芯片已在生物學研究、疾病診斷、藥物篩選、毒理學研究等諸多領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，展示了廣闊的應用前景。相比傳統(tǒng)的二維電泳、質(zhì)譜以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)來說，小型化的蛋白質(zhì)微陣列芯片具有分析通量高、樣品用量少、檢測時間短、分析成本低，實驗結(jié)

2、果可靠性高等優(yōu)點。對于用抗體作為捕獲分子的抗體微陣列芯片來說，如何提高抗體的固定容量和穩(wěn)定性，保持抗體的反應活性，降低非特異性吸附，是開發(fā)高性能抗體芯片的核心問題。目前有很多種方法如戊二醛修飾法、巰基修飾法、納米共聚物刷修飾法等，通過各種不同的活化試劑與基底表面發(fā)生化學反應將基底表面鍵合上不同的活性基團，以便于抗體的固定。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴構(gòu)建含有苯硼酸功能基團的納米聚合物刷介導的定向抗體固定。通過硅烷化成功地在玻片表面

3、引入氨基活性基團，接下來通過表面引發(fā)自由基聚合的方法將甲基丙烯酸縮水甘油酯（Glycidyl methacrylate， GMA）聚合在玻片表面，形成一層厚度和密度可控的聚合物刷。再通過PGMA聚合物刷上的環(huán)氧基與3-氨基苯硼酸(APBA)上的氨基發(fā)生反應最終將苯硼酸基團引入到玻片表面。該種方法既發(fā)揮了共聚物刷三維結(jié)構(gòu)和靈活性的優(yōu)點，同時通過僅存在于抗體分子非功能域（Fc段）的糖鏈實現(xiàn)抗體的定向和共價固定。
　　⑵甲基丙烯酸縮水甘

4、油酯聚合物刷修飾玻片（PGMA玻片）與甲基丙烯酸縮水甘油酯-氨基苯硼酸納米共聚物刷修飾玻片（PGMA-APBA玻片）性能對比研究。通過對PGMA玻片與PGMA-APBA玻片兩種基底抗體固定量、免疫反應效率和信噪比的研究，來比較兩種芯片基底修飾方法的優(yōu)缺點。實驗結(jié)果表明，雖然PGMA玻片抗體固定量高于PGMA-APBA玻片的抗體固定量，但由于PGMA-APBA玻片是通過硼酸基團與抗體Fc區(qū)域的糖鏈發(fā)生反應將抗體定向的固定于基地表面，而PG

5、MA玻片只是通過化學反應將抗體隨意的共價固定在基底表面，導致PGMA-APBA玻片的免疫反應效率和信噪比都要優(yōu)于PGMA玻片。
　?、腔赑GMA-APBA玻片的高靈敏抗體微陣列芯片的構(gòu)建及其性能評價。用兔免疫球蛋白(Immunoglobulin，IgG)作為模型蛋白，對在兩種不同修飾的基底上進行免疫分析，從實驗結(jié)果看，PGMA-APBA玻片上免疫分析的動態(tài)檢測范圍為10 pg mL-1到1μg mL-1，最低檢測限為1 pg m

6、-1。PGMA玻片上，檢測限為10pg mL-1，動態(tài)檢測范圍為100pgmL-1到1μg mL-1。對比PGMA玻片與PGMA-APBA玻片，其免疫分析的檢測限和動態(tài)監(jiān)測范圍都不及PGMA-APBA玻片。
　　⑷構(gòu)建新型納米聚合物刷介導的三維微流控免疫測定裝置。為進一步提高芯片基底的有效使用面積以及單位體積內(nèi)蛋白固定密度，實現(xiàn)多維度的蛋白固定與分析。將玻璃長方體作為芯片基底，圓柱形玻璃毛細管作為微流控通道，通過將其與流動泵進行簡

7、單的組合成三維的微流控免疫測定裝置。進一步研究三維裝置內(nèi)蛋白固定量、免疫反應效率以及信噪比等性能來與傳統(tǒng)二維微流控芯片進行對比。
　?、蛇x擇甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)腫瘤標志物作為模型蛋白制備檢測芯片，并評價芯片性能以及在臨床檢測方面中的應用。將AFP、CEA腫瘤標志物作為模型蛋白對三維芯片裝置的性能進行評價，從抗體固定量、免疫反應效