刺糖多孢菌菌株遺傳改良的研究.pdf

1、新型的微生物源殺蟲劑多殺菌素是由放線菌刺糖多孢菌(Saccharopoly sporaspinosa)經(jīng)有氧發(fā)酵后產(chǎn)生的一種胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物。因其對農(nóng)業(yè)害蟲有著極好的殺蟲效果，而對哺乳動物、魚類、鳥類和大多數(shù)益蟲具有極高的安全界限，兼具化學(xué)農(nóng)藥的高效性與生物農(nóng)藥的安全性，正成為最具發(fā)展前景的新一代殺蟲劑。但其產(chǎn)量低下，且發(fā)酵周期長達(dá)二至三周，使得生產(chǎn)成本極高，嚴(yán)重制約了其生產(chǎn)及實際應(yīng)用。因此，進行菌種改良，以盡可能地提高多殺菌素產(chǎn)量，成

2、為了開發(fā)該種殺蟲劑最迫切需要解決的問題之一。傳統(tǒng)的理化誘變和篩選雖然有效，但有工作量大并且不能定向等缺陷。本研究嘗試從原生質(zhì)體融合和啟動子替換兩方來提高多殺菌素產(chǎn)量。
　　 本研究中利用PCR分別從紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)NRRL2338擴增了其eryAI基因內(nèi)部1.1kb的同源片段，從刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)SP06081中擴增了7.8kb的

3、spnA基因和2.7kb的tspnA基因片段(spnA基因起始模塊的一部分)。
　　 將該eryAI基因內(nèi)部的同源片段經(jīng)雙酶切之后與載體pOJ260相連接，構(gòu)建了阻斷紅色糖多孢菌產(chǎn)紅霉素的載體pOJ260D。將載體pOJ260D轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567(pUZ8002)，然后與紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)NRRL2338接合轉(zhuǎn)移。培養(yǎng)若干天后，挑取轉(zhuǎn)化子在含有適宜濃度阿伯拉霉素(Apr

4、amycin)的BHI平板轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2次，得到了一株不產(chǎn)紅霉素的紅色糖多孢菌-紅色糖多孢菌D。經(jīng)過根據(jù)阿伯拉霉素抗性基因設(shè)計的引物的PCR分析，紅色糖多孢菌D的分子核酸特征得到了驗證。將紅色糖多孢菌D進行固體平板培養(yǎng)，進行形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)色素的量較原始菌株紅色糖多孢菌NRRL2338多；將紅色糖多孢菌D進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，HPLC檢測其已經(jīng)不產(chǎn)紅霉素。
　　 將紅色糖多孢菌D和刺糖多孢菌SP06081分別培養(yǎng)制備原生質(zhì)體，然后融合

5、。隨機挑取再生平板上80個菌落經(jīng)加有適宜濃度阿伯拉霉素的固體平板轉(zhuǎn)接培養(yǎng)兩次后，分別搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，HPLC檢測菌株產(chǎn)多殺菌素情況，得到4株產(chǎn)多殺菌素的融合菌株。取融合菌發(fā)酵液HPLC收集峰液做質(zhì)譜分析，進一步證實融合菌株產(chǎn)生多殺菌素。
　　 基于4株融合菌株多殺菌素產(chǎn)量都不及起始菌株高，我們接著采用不加抗生素直接篩選的方法，成功篩選到若干高產(chǎn)多殺菌素的融合菌株，其中菌株B-2多殺菌素產(chǎn)量提高最為明顯，較原始菌株增加了331％。后

6、續(xù)傳代培養(yǎng)表明融合菌株B-2多殺菌素產(chǎn)量穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定性較好。
　　 將tspnAPCR產(chǎn)物雙酶切之后然后與載體pLSB2連接，構(gòu)建了刺糖多孢菌啟動子替換載體pLSB2-tspnA，并成功轉(zhuǎn)入具有接合轉(zhuǎn)移功能的大腸桿菌S17-1中，得到了工程菌株S17-1(pLSB2-tspnA)，準(zhǔn)備結(jié)合轉(zhuǎn)移操作。
　　 本文對紅色糖多孢菌和刺糖多孢菌原生質(zhì)體融合進行了研究并且成功提高了多殺菌素的產(chǎn)量，這為具有優(yōu)良發(fā)酵特性的紅色糖多孢