基因突變對細菌視紫紅質功能的影響及相關功能材料研究.pdf

1、二十一世紀是生命科學高速發(fā)展的世紀。生命科學不僅自身得到了快速發(fā)展，生命科學和材料科學的結合還有助于增強生命物質相關的特殊功能材料的研發(fā)。細菌視紫紅質(簡稱BR)是一種將光能轉換成化學能或生理信號的光響應蛋白質，穩(wěn)定存在于紫膜(PM)當中，有望作為一種具備光響應特性的功能材料的基本成份。作為視黃醛蛋白質家族新成員，古細菌視紫紅質(簡稱AR4)與BR具有相似的結構和功能。兩者功能上的差異凸顯了結構與功能之間的密切關系。如何進一步闡明其內(nèi)在

2、關系，又能同時開展相關功能材料的基礎研究，是目前視黃醛膜蛋白分子研究的重點之一。
　　 本博士論文以分子生物學技術為基礎，從生物和材料交叉學科的角度入手，通過比較兩種視黃醛蛋白質BR和AR4之間的差異，一方面嘗試獲得新的穩(wěn)定基因突變體揭示視黃醛蛋白質內(nèi)在的結構與功能的特性，另一方面運用突變體蛋白質與合成高分子復合制備光信息存儲膜及蛋白質光感受器微陣列的原型材料。此外，還探索了細菌視紫紅質紫膜的新功能。
　　 本論文的主要

3、創(chuàng)造性工作為：
　　 (一)通過比較兩種視黃醛蛋白質BR和AR4一級結構的差異，運用基因工程定點突變方法，設計并獲得包括K41E和D102K等六個新的BR突變體。通過對突變體性能的研究，排除了第41位賴氨酸和第102位天冬氨酸是決定質子提取釋放順序反向的關鍵氨基酸，并證實質子釋放基團(PRC)的pKa值決定質子提取釋放的順序。雖然這兩個帶電荷的殘基并不是BR和AR4中影響質子提取釋放順序的關鍵氨基酸，但是這些突變體確實對光循環(huán)產(chǎn)

4、生了影響，比如降低了D96的質子親和能力以及質子從質子通道向D96的傳遞速率。此外與野生BR相比，突變體中D102K光循環(huán)中M中間態(tài)和質子提取的時間延長3倍。因此這些殘基可能涉及內(nèi)部質子供體對質子的提取和釋放。
　　 (二)制備了第96位天冬氨酸被纈氨酸取代的BR突變體D96V及其高分子復合膜，并進行了相關基礎研究。通過基因工程方法，在本身不表達BR的嗜鹽菌L33中實現(xiàn)了新突變體D96V的表達。具有強疏水性的纈氨酸取代天冬氨酸后

5、，所得突變體蛋白質仍然具有光學響應。與野生型BR相比，中性的鹽溶液環(huán)境中突變體D96V的M態(tài)壽命延長近兩個數(shù)量級，有利于未來作為信息材料使用。將此突變體蛋白質與合成高分子聚乙烯醇(PVA)混合后制備得到蛋白質/聚合物復合功能膜，M態(tài)壽命比液體條件下又有顯著的延長。此外，我們還發(fā)現(xiàn)D96V中間態(tài)的壽命對于體系的含水量具有較高的敏感性。
　　 (三)發(fā)現(xiàn)該蛋白質形成的紫膜具有一種新功能--抗細胞黏附，并進一步聯(lián)合生物、化學和物理的方

6、法制備了具有細胞黏附反差的視蛋白光感受器微陣列。將小鼠成骨細胞前體細胞MC3T3-E1、小鼠成纖維細胞NIH3T3細胞等哺乳動物細胞接種到紫膜表面培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)紫膜具有強烈的抗拒細胞黏附的作用。接種細胞無法在紫膜上黏附、鋪展，并且紫膜對細胞黏附具有長時間的抵抗效果。這樣提供了一種嶄新的既有光學響應、又抗污的天然大分子。另一方面，采用基因工程點突變方法引入半胱氨酸取代BR中第36位的天冬氨酸，從而使原本不帶巰基的BR的表面獲得巰基，并與金產(chǎn)生

7、共價連接，增強了微陣列的穩(wěn)定性和分辨率。利用電沉積法，包含BR和磷脂的紫膜膜片在直流電場中統(tǒng)一取向后附著在金微米陣列上。BR膜一旦靠近金電極，巰基與金即形成共價鍵。紫膜各層之間則利用偶聯(lián)劑使相鄰層之間形成化學交聯(lián)，在保證其高度穩(wěn)定性的同時顯著增強蛋白質微陣列的光電信號。物理附著的BR蛋白質分子最終被表面活性劑Triton X-100清除，即得到結構穩(wěn)定且單點分布的蛋白質微陣列。取向的視蛋白不僅保留了生物活性，光激發(fā)后還能產(chǎn)生累加的電信號